劉 振，唐 蕾，*，王海鷗，毛忠貴，張 玲，王 武

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫，214122)

綠葉蔬菜采后失綠直接影響產(chǎn)品感官品質(zhì)和貨架壽命。失綠源于葉綠素降解。葉綠素是含鎂的卟啉類光合色素，在高等植物中分為葉綠素a和葉綠素b。目前認為葉綠素降解始于葉綠素a，葉綠素b轉(zhuǎn)化為葉綠素a后，先脫去卟啉環(huán)中鰲合的鎂生成脫鎂葉綠素a，再經(jīng)脫鎂葉綠素酶(PPH)的作用生成脫鎂葉綠酸a，然后由脫鎂葉綠酸a單加氧酶(PaO)催化卟啉環(huán)的開環(huán)［1］。由此可見，在葉綠素降解過程中酶的作用至關(guān)重要。所以研究采后處理與貯藏條件對葉綠素降解相關(guān)酶活性的影響，進而控制葉菜采后失綠，提高品質(zhì)、延長貨架期具有實用價值。然而目前相關(guān)方面的理論研究尚十分有限。芥藍(Brassica alboglabra L.)是我國南方特有的蔬菜品種之一，因其質(zhì)脆、清鮮、營養(yǎng)豐富深受廣大消費者喜愛，并且遠銷東南亞等國家和地區(qū)［2－3］。作為鮮食蔬菜，采后護綠是芥藍保鮮的一個重要方面。對于需要較長時間貯運且保持良好品質(zhì)的芥藍，如出口銷售芥藍，低溫是常用的保鮮方法。短波紫外線(UV－C)輻照作為一種安全、無污染的綠色環(huán)保保鮮方式，近年來受到廣泛關(guān)注。通過使用適宜的紫外線輻照果蔬，可以影響其多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、抗氧化酶等的表達［4］。上述兩種方法對芥藍貯藏過程中葉綠素及其相關(guān)降解酶類的影響尚未見報道。為此本文進行了溫度以及UV－C輻照對貯藏過程中葉綠素含量及PPH活性變化的影響，試圖為控制芥藍采后失綠提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芥藍葉片 市購芥藍，清水洗凈，吸干表面水分，選取飽滿嫩綠，新鮮度大小基本一致，無病蟲害，無機械損傷的葉片;葉綠素a 購自美國Sigma公司，經(jīng)酸化處理為脫鎂葉綠素a;BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒 購自上海生工生物工程有限公司;其他試劑 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

冷凍離心機 美國Sigma公司;Unico UV－2100紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司;光照培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司;紫外燈(15w，254 nm)佛山電器照明股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠素含量的測定 取0.2g芥藍葉片，加液氮研成粉末，轉(zhuǎn)入15mL帶塞離心管中，加80%的丙酮水溶液，避光浸提，5000r/min離心10min，吸取上清液稀釋一倍后測定645及663nm處的吸光值，按照Aron公式計算葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量［5］。

1.2.2 PPH活力的測定方法 參照Aiamla－or等的方法并予以改進［6］。

丙酮粉制備:取10g葉片，加入冷丙酮(－20℃)勻漿，濾紙抽濾，冷丙酮洗濾，室溫干燥，－20℃貯藏備用。

酶液制備:取上述丙酮粉 0.5g，加入 25mL 50mmol/L的Tris－HCl(pH8.0)，冰浴攪拌1h后用2層紗布過濾，濾液在4℃下10000r/min離心15min。上清液用45%～80%飽和硫酸銨沉淀，沉淀用緩沖液溶解，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

PPH活性測定:反應(yīng)混合液由0.35mL酶液，75μL 2.0% Triton X－100，0.1mL 脫鎂葉綠素 a(10μmol/L)，0.7ml 50mmol/L Tris－HCl(pH8.0)組成。反應(yīng)于暗處25℃下進行。90min時加入丙酮至終濃度為25%終止反應(yīng)。然后，加入3mL的正己烷萃取脫鎂葉綠素a，于667nm測定在丙酮層中的脫鎂葉綠酸a的吸光值。PPH活性以每分鐘生成1μmol脫鎂葉綠酸a為一個酶活單位(U)。

1.2.3 蛋白含量測定 按照“BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒”(上海生工生物工程有限公司)說明書的操作測定酶液中總蛋白的含量。以牛血清白蛋白(BSA)作為標準蛋白。

1.2.4 UV－C處理與貯藏 將芥藍葉片置于紫外燈下分別照射 5、10、15、20min，期間翻轉(zhuǎn)葉片，使葉面輻照均勻。以不照射為對照，處理完畢后，放入保鮮袋中，置于暗處22℃貯藏5d。分別在第0、1、3、5d的同一時間取樣測定葉綠素含量、PPH活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 每個指標測定均重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度對葉綠素降解的影響

2.1.1 貯藏溫度對葉綠素含量的影響 溫度對植物葉綠素降解有不同的影響，秋季落葉樹木的綠色隨溫度的降低而消退，而對采后蔬菜而言，降低貯藏溫度一般能使綠色穩(wěn)定。然而，某些蔬菜在－18℃時仍有葉綠素降解現(xiàn)象發(fā)生［7］。在本實驗中我們探討了溫度對貯藏過程中葉綠素a、b的影響。選取的溫度為常溫22℃和低溫4℃。結(jié)果表明，低溫貯藏的葉綠素降解速度明顯低于常溫貯藏(圖1)。第5d較第0d，低溫組葉綠素a和b的含量分別下降了9.74%和17.15%，而常溫貯藏的芥藍葉綠素a和b的含量分別下降了85.43%和93.92%。

圖1 溫度對芥藍貯藏過程葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of temperature on chlorophyll a and b contents during storage

2.1.2 貯藏溫度對PPH的影響 PPH專一催化脫鎂葉綠素a生成脫鎂葉綠酸a［8］，為PAO的開環(huán)反應(yīng)提供了唯一的底物。PPH的發(fā)現(xiàn)改變了以往認為:葉綠素酶是葉綠素降解的第一步的觀點［9］。由于PPH較其他參與葉綠素降解的酶發(fā)現(xiàn)遲，對其研究尚十分有限。有研究表明在與芥藍同屬的花椰菜(Brassica oleracea L.)的采后處理中，葉綠素的降解與PPH的表達量相關(guān)［10］。為此本文研究了貯藏溫度對PPH活力的影響，以第0d的PPH活力(14.5mU/g蛋白)為100%，探討其在貯藏過程中的變化與葉綠素降解之間的關(guān)系。結(jié)果表明22℃貯藏時，PPH活性在前期快速升高，第3d時約為第0d的200%，第5d時酶活性降低，約為第0d的35%，而在4℃貯藏時，PPH活性雖然一直上升，但增速緩慢，第3d時僅為第0d的135%，并且前3d的活性始終低于22℃時的水平。因此低溫貯藏可能因為抑制前期PPH活性的迅速上升，從而延緩了葉綠素的降解(圖2)。

2.2 短波紫外線輻照對葉綠素降解的影響

2.2.1 輻照時間對葉綠素含量的影響 波長在200～400nm的電磁輻射稱為紫外輻射，其中波長范圍為200～280nm為短波紫外光UV－C。UV－C對大多數(shù)微生物具有殺滅作用，因此作為一種操作簡單、無污染的殺菌方法很早即被應(yīng)用于食品工業(yè)中。近年的研究表明UV－C除了殺菌之外，還可以影響到蛋白質(zhì)、VC等營養(yǎng)物質(zhì)以及抗氧化酶等酶類的表達，在提高葉菜、果蔬的貯藏期品質(zhì)，延緩其后熟、衰老過程發(fā)揮積極作用［11－14］。

圖2 溫度對貯藏過程PPH活性變化的影響Fig.2 Effect of temperature on PPH activity during storage

在葉菜的保鮮中防止黃化，抑制葉綠素降解，是關(guān)鍵因素之一。為此本研究考察了UV－C處理與葉綠素含量的關(guān)系。結(jié)果表明UV－C照射能夠有效延緩葉綠素含量的下降，并隨著輻照時間的延長，葉綠素的降解越緩慢(圖3)。該效果在貯藏前期更為顯著，當輻照20min，22℃貯藏3d時，葉綠素a的含量為0.49mg/g FW，是對照的1.75倍;葉綠素b的含量為0.16mg/g FW是對照的2.14倍(圖4)。

圖3 UV－C輻照時間對貯藏過程葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of UV－C irradiation time on chlorophyll content during storage

圖4 UV－C輻照20min對貯藏過程葉綠素a及葉綠素b含量的影響Fig.4 Effect of 20min UV－C irradiation on chlorophyll a and b contents during storage

2.2.2 UV－C輻照對PPH活性的影響 為了進一步研究UV－C輻照減緩葉綠素降解的原因，本文對經(jīng)輻照處理的芥藍在貯藏過程中PPH活性的變化進行了研究。輻照時間為20min，貯藏溫度為22℃，避光。UV－C輻照后PPH活力下降，僅為未輻照的67%。以第0d的PPH酶活為100%。結(jié)果表明與對照相比，UV－C輻照抑制了貯藏前期PPH酶活性的迅速上升，與第0d相比，未經(jīng)輻照的芥藍在第1d的PPH酶活上升了50%，而UV－C輻照處理的僅上升了14%(圖5)。之后，PPH活性上升加快，第3d較第1d上升了112%，相應(yīng)葉綠素降解明顯，總?cè)~綠素含量由第1d時0.97mg/g FW降至第3d的0.66mg/g FW，下降了32%(圖3)。

圖5 UV－C輻照20min對貯藏過程PPH酶活性變化的影響Fig.5 Effect of 20min UV－C irradiation on PPH activity during storage

葉綠素降解是一個多酶參與的生化過程，酶的表達調(diào)節(jié)在不同植品種和不同生理條件下有所不同。PPH作為一種新發(fā)現(xiàn)的酶，對其的研究報道還十分有限，而且結(jié)果也不盡相同。Büchert等對花椰菜采后熱空氣、UV－C、光照和氣體成分對葉綠素降解相關(guān)酶基因表達的影響表明:熱、UV－C和光照處理延緩了葉綠素降解，同時調(diào)節(jié)了PPH的表達，而氣體成分雖然阻礙了葉綠素降解卻未能抑制PPH的表達［15］。Aiamla－or等發(fā)現(xiàn)葉綠素含量的下降與 PPH的活性增加相一致，較長波長的紫外輻照(UV－B)處理有效地抑制了葉綠素的降解，PPH活性的增強在處理后的前兩天略有降低，隨后與對照同樣上升［6］。本文的研究結(jié)果與Aiamla－or等的更為相似，具體表現(xiàn)在芥藍葉綠素降解與PPH活性相關(guān)聯(lián)，在常溫及未經(jīng)UV－C處理的芥藍中，葉綠素在第0d到第3d內(nèi)快速降解，PPH活性增加;在此之后即從第3d到第5d時，葉綠素降解減緩，PPH活性明顯下降。而低溫和UV－C處理抑制了PPH酶的上升速度，因而減緩了葉綠素的降解。但是，并未發(fā)現(xiàn)葉綠素含量與PPH酶活性之間存在定量關(guān)系，分析可能與參與葉綠素降解的其他酶有關(guān)。

3 結(jié)論

低溫和UV－C輻照作為一種安全、無污染的綠色環(huán)保保鮮方式可延長蔬菜的貨架壽命。本研究的結(jié)果表明上述處理方法可抑制葉綠素降解途徑中PPH活性的迅速上升，從而延緩了貯藏過程中葉綠素的降解，對芥蘭采后持綠方法的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

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