段相會(huì) 李橋川

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，南寧市 530021)

基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)是趨化因子CXC亞家族成員，研究顯示SDF-1在造血干/祖細(xì)胞(HSPC)的遷移、增殖及分化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，但其作用尚未完全清楚［1］。鑒于此，我們通過(guò)研究 SDF-1對(duì) UCB CD34+細(xì)胞增殖及遷移功能的影響，了解 SDF-1對(duì)HSPC的作用，并探討SDF-1應(yīng)用于UCB HSPC體外培養(yǎng)的可能性。

1 材料和方法

1．1 標(biāo)本來(lái)源和細(xì)胞制備 無(wú)菌采集健康足月產(chǎn)新生兒臍血，應(yīng)用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞(MNC)。應(yīng)用MACS CD34+細(xì)胞單選試劑盒(Miltenyi Biotch Inc．Sunnyvale，CA)，按試劑盒說(shuō)明分離純化CD34+細(xì)胞。

1．2 檢測(cè)SDF-1對(duì)CD34+細(xì)胞體外凋亡的影響 將分選的CD34+細(xì)胞加入到 IMDM(GIBCO Inc．，USA)培養(yǎng)基中，調(diào)細(xì)胞密度為1×105/mL，接種24孔板，每孔加入1 mL，分6組，每組復(fù)設(shè)3孔。1組為對(duì)照組，不加SDF-1;其余5組為實(shí)驗(yàn)組，加入不同濃度的 SDF-1(1、50、100、500、1 000 ng/mL)。于 37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。第4天計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)、存活細(xì)胞數(shù)與加入細(xì)胞數(shù)的比值為生存率。按試劑盒說(shuō)明使用AnnexinV:FITC Apoptosis Detction Kit I(BD Pharmmgen，USA)，用流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson FACSVantage)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。SDF-1為Peprotech EC公司產(chǎn)品。

1．3 檢測(cè)SDF-1對(duì)UCB CD34+細(xì)胞體外集落培養(yǎng)的影響 培養(yǎng)基為甲基纖維素培養(yǎng)基MethoCultTMGF+H4435(Stem Cell Tech Inc．，Canada)，內(nèi)含細(xì)胞因子 SCF 50 ng/mL，IL-3、IL-6、GM-CSF 和 G-CSF 各為 20 ng/mL以及Epo 3 U/mL。接種純化的CD34+細(xì)胞500 ng/mL，每份標(biāo)本接種24孔板3孔，每孔0．5 mL。1組為對(duì)照組:不加SDF-1;其余5組為實(shí)驗(yàn)組:加入不同濃度的SDF-1(1 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL)。于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)28 d，在第14天計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞以上的粒/單－集落形成單位(CFU-GM)、紅系爆式－集落形成單位(BFU-E)和混合－集落形成單位(CFU-MIX)，在第28天計(jì)數(shù)高增殖潛能－集落形成單位(HPP-CFU)，標(biāo)準(zhǔn)為直徑＞0．5 mm、細(xì)胞數(shù)＞50 000的高密度粒/單細(xì)胞型集落。

1．4 SDF-1對(duì)UCB CD34+細(xì)胞黏附能力的影響 檢測(cè)新分選的臍血CD34+細(xì)胞(對(duì)照組)、在37℃下與SDF-1(50 ng/mL)孵育 2 h的新鮮臍血 CD34+細(xì)胞(SDF-1組)。用含20μg/mL人纖連蛋白(FN)的PBS包被96孔板，50μl/孔，4℃過(guò)夜。用PBS洗3次，再用100μl/阻斷緩沖液(含20 g/L BSA的IMDM)37℃阻斷2 h，PBS洗3次。將CD34+細(xì)胞懸浮于黏附緩沖液(含5 g/L BSA的IMDM)，調(diào)細(xì)胞密度為1×105/mL，加入孔板，100μl/孔。每份標(biāo)本分3組:A組為不加細(xì)胞只加100μL黏附緩沖液的空白組;B組為CD34+細(xì)胞組;C組為CD34+細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組。每組復(fù)設(shè)3個(gè)孔。37℃孵育1 h，吸去B組緩沖液和非黏附細(xì)胞。用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞與FN間的黏附效率。具體操作如下:用黏附緩沖液輕輕洗滌B組細(xì)胞三次，盡量去除所有非黏附細(xì)胞后加入100μL黏附緩沖液。100μL細(xì)胞懸液中加入MTT 20μL(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，離心棄上清，加二甲基亞砜 100μl/孔，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀(SLT SPECTRAⅡ型)在570 nm處測(cè)吸光度(A570)。黏附率(%)×100%

1．5 SDF-1對(duì)UCB CD34+細(xì)胞遷移能力的影響 我們?cè)O(shè)新分選的臍血CD34+細(xì)胞為對(duì)照組，新分選的臍血CD34+細(xì)胞在37℃下與SDF-1(50 ng/mL)孵育2 h為SDF-1組。趨化試驗(yàn)采用 5μm的 transwell板(24-well cell，cluster;Costar，Corning Inc．，USA)，實(shí)驗(yàn)前用趨化緩沖液(含5 g/L BSA的IMDM)漂洗濾膜1次，吸去上清。將CD34+細(xì)胞懸浮于趨化緩沖液中，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL，transwell板的上層添加細(xì)胞懸液100μL，下層添加趨化緩沖液600μL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組復(fù)設(shè)兩孔。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5．0%的CO2條件下孵育4 h，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的遷移率。具體方法如下:將transwell板下層的細(xì)胞收入管中，另取原細(xì)胞懸液100μL加緩沖液500μL，振蕩混勻，分別用流式細(xì)胞儀高速計(jì)細(xì)胞數(shù)20 s。每孔計(jì)數(shù)3次，取平均值。我們?cè)O(shè)對(duì)照組的遷移率為100%，SDF-1組的遷移率與對(duì)照組相比較為相對(duì)遷移率。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 10．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)描述為±s，數(shù)據(jù)采用方差分析，P ＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 SDF-1對(duì)UCB CD34+細(xì)胞凋亡及生存的影響 加入SDF-1的實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P＜0．05，n=4)，加入SDF-1的實(shí)驗(yàn)組的生存率顯著高于對(duì)照組，劑量與效應(yīng)相關(guān)，加入SDF-1 50 ng/mL即與對(duì)照組存在顯著性差異，加入SDF-1 100 ng/mL即達(dá)到最大效應(yīng)，進(jìn)一步增加劑量并不能進(jìn)一步增加抑制凋亡效應(yīng)。提示SDF-1能夠通過(guò)抑制UCB CD34+細(xì)胞凋亡增強(qiáng)其體外生存能力。結(jié)果見表1。

表1 SDF-1對(duì)CD34+細(xì)胞凋亡及生存的影響 (%±s)

表1 SDF-1對(duì)CD34+細(xì)胞凋亡及生存的影響 (%±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0．05。

組別 凋亡率 生存率對(duì)照組18．99 ±2．23 53．75 ±4．84 1 ng/mL 18．32 ±1．82 51．30 ±3．42 50 ng/mL 12．22 ±1．15* 76．25 ±2．17*100 ng/mL 9．26 ±1．22* 79．38 ±3．13*500 ng/mL 13．20 ±1．73* 70．00 ±2．70*1 000 ng/mL 13．25 ±2．27* 73．38 ±4．84*

2．2 SDF-1對(duì)UCB CD34+增殖的影響 加入SDF-1可提高CFU-GM產(chǎn)率，加入SDF-1 50 ng/mL即與對(duì)照組存在顯著性差異(P＜0．05)。加入SDF-1導(dǎo)致BFU-E產(chǎn)率減低，呈劑量依賴，加入SDF-1達(dá)到或超過(guò)100 ng/mL時(shí)與對(duì)照組存在顯著性差異(P＜0．05)。各組間的CFU-MIX、HPP-CFU產(chǎn)率無(wú)顯著性差異(P＞0．05)。結(jié)果見表2。

表2 SDF-1對(duì)CD34+細(xì)胞增殖的影響 (集落數(shù)/2500個(gè)CD34+細(xì)胞±s)

表2 SDF-1對(duì)CD34+細(xì)胞增殖的影響 (集落數(shù)/2500個(gè)CD34+細(xì)胞±s)

注:與對(duì)照組組比較，*P ＜0．05。

Group BFU-E CFU-GM CFU-MIX HPP-CFC對(duì)照組 204．00 ±13．77 371．50 ±61．96 41．25 ±4．32 38．75±4．09 1 ng/mL 201．50 ±14．47 390．00 ±65．74 42．25 ±4．97 39．25 ±4．75 50 ng/mL 186．25 ±10．62 493．50 ± 58．61* 39．00 ±5．73 38．75 ±3．93 100 ng/mL 176．75 ±10．24* 531．00 ±79．2* 43．25 ±5．64 42．25 ±4．44 500 ng/mL 167．25 ±10．92* 514．50 ±75．63* 39．25 ±6．63 39．25 ±4．15 1 000 ng/mL 149．50 ±7．64* 454．40 ±56．29*38．25 ±4．87 39．75 ±3．40

2．3 SDF-1對(duì)UCB CD34+歸巢相關(guān)功能的影響 經(jīng)SDF-1(50 ng/mL)作用后的新鮮臍血CD34+細(xì)胞的黏附率為(68．05±4．95)%，顯著高于對(duì)照組的(55．83±4．20)%(P ＜ 0．05，n=3)。 經(jīng) SDF-1(50 ng/mL)作用后的新鮮臍血CD34+細(xì)胞的相對(duì)遷移率為(148．04±3．21)%，顯著高于對(duì)照組的 100．00%(P ＜0．05，n=3)。

3 討論

臍帶血造血干細(xì)胞移植(CBT)已經(jīng)成功應(yīng)用于治療各種血液病，但單份UCB里的HSPC數(shù)量不足及UCB HSPC的歸巢功能缺陷等影響CBT移植療效。通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增UCB HSPC的數(shù)量及增強(qiáng)其歸巢能力是解決該問(wèn)題的方法之一，仍需要進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化體外培養(yǎng)細(xì)胞因子組合方案［1］。我們將 SDF-1加入到 UCB CD34+細(xì)胞培養(yǎng)體系中，研究SDF-1能否有利于UCB HSPC生存及增殖，能否增強(qiáng)UCB CD34+細(xì)胞歸巢相關(guān)功能。

Lataillade 等［3，4］研究認(rèn)為，SDF-1 能抑制 CD34+細(xì)胞凋亡，SDF-1能抑制Bad和Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達(dá)，該效應(yīng)與SDF-1能夠激活CD34+的PI-3K-AKT和MAPK途徑相關(guān)。本研究證明SDF-1能夠通過(guò)抑制UCB CD34+細(xì)胞凋亡而增強(qiáng)其體外生存能力，呈劑量依賴性，UCB CD34+細(xì)胞培養(yǎng)體系中SDF-1濃度達(dá)到或超過(guò)50 ng/mL可產(chǎn)生顯著的抑制凋亡效應(yīng)，使UCB CD34+細(xì)胞生存率提高。

目前SDF-1對(duì)HSPC增殖功能的影響還存在爭(zhēng)議。Lataillade 等［3，4］研究認(rèn)為，SDF-1(0．01 ～ 0．5 ng/mL)能夠誘導(dǎo)人周血CD34+細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期，與SCF等生長(zhǎng)因子協(xié)同可以進(jìn)一步擴(kuò)增人周血CD34+Lin－細(xì)胞數(shù)量及促進(jìn)造血祖細(xì)胞集落形成。然而Gibellini等［5］報(bào)道，SDF-1在200 ng/mL的濃度條件下選擇性抑制紅系分化，其機(jī)制可能是與 SDF-1上調(diào) Fas/CD95 ligand表達(dá)有關(guān)。Vichalkovskia等［6］研究認(rèn)為，SDF-1 選擇性抑制紅系分化，其機(jī)制可能是SDF-1刺激后在紅系定向祖細(xì)胞會(huì)形成與蛋白激酶C(PKC)β和c-Abl相關(guān)的發(fā)育調(diào)節(jié)負(fù)反饋，而在多潛能祖細(xì)胞該負(fù)反饋不會(huì)被激活，SDF-1并不抑制HSPC的增殖。上述研究提示，爭(zhēng)議存在的原因在于不同的研究使用的細(xì)胞類型不同、SDF-1濃度差異和有無(wú)其他造血因子協(xié)同的影響。本研究結(jié)果顯示，在甲基纖維素培養(yǎng)基 H4435中加入SDF-1可增加CFU-GM的產(chǎn)率，SDF-1對(duì)粒系增殖影響呈濃度依賴性，SDF-1達(dá)到或超過(guò)50 ng/mL時(shí)CFU-GM的產(chǎn)率顯著高于對(duì)照組。同時(shí)，SDF-1與其他造血因子協(xié)同(SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF 和 Epo)可在一定程度上促進(jìn)粒系祖細(xì)胞增殖。此外，SDF-1抑制紅系祖細(xì)胞增殖的影響呈濃度依賴，SDF-1達(dá)到或超過(guò)100 ng/mL時(shí)BFU-E的產(chǎn)率顯著低于對(duì)照組，但低濃度SDF-1對(duì)紅系祖細(xì)胞增殖的抑制并不顯著。而且我們前期研究也提示SDF-1并不抑制HSPC的增殖［7］。

本研究顯示經(jīng)SDF-1(50ng/mL)作用后的新鮮臍血CD34+細(xì)胞的黏附率、遷移率顯著高于未經(jīng)SDF-1作用的新鮮臍血 CD34+細(xì)胞。結(jié)果提示，SDF-1與 UCB CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)能夠增強(qiáng)其歸巢相關(guān)功能，有利于糾正UCB CD34+細(xì)胞的歸巢功能缺陷問(wèn)題。

總之，SDF-1能夠通過(guò)抑制UCB CD34+細(xì)胞凋亡增強(qiáng)其生存能力，與其他造血生長(zhǎng)因子協(xié)同能夠促進(jìn)粒系增殖，能夠提高UCB CD34+細(xì)胞歸巢相關(guān)功能，因此SDF-1能應(yīng)用于UCB CD34+細(xì)胞體外培養(yǎng)。

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