張 英， 黎宏宇， 李 莉， 楊 舉， 成 軍， 郝林琳， 于 浩

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春130062)

0 引言

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的利用流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer)快速定量分析細(xì)胞群的物理、化學(xué)特征以及利用這些特征精確分選細(xì)胞的新型技術(shù)，主要包括流式分析、流式分選兩部分。流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)及流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展是多學(xué)科領(lǐng)域高度發(fā)展的結(jié)晶，其中涉及到細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物技術(shù)、分子免疫學(xué)、單克隆抗體技術(shù)、電子物理技術(shù)、納米技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、熒光化學(xué)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等多個(gè)領(lǐng)域［1-2］。

FCM既可以測(cè)量細(xì)胞大小、細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度、細(xì)胞表面積、核漿比例、DNA含量、RNA及蛋白質(zhì)含量，也可以檢測(cè)細(xì)胞表面/胞漿的特異性抗原、細(xì)胞活性、細(xì)胞因子、細(xì)胞受體、激素結(jié)合位點(diǎn)等，該技術(shù)作為一種快速細(xì)胞分析技術(shù)，不僅應(yīng)用于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生理學(xué)等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，更廣泛應(yīng)用于臨床的各個(gè)方面，如腫瘤學(xué)、血液學(xué)(血常規(guī)檢查)、藥物學(xué)、臨床檢驗(yàn)等各方面［3-5］。

因此，2009年吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部利用985項(xiàng)目建設(shè)平臺(tái)，引進(jìn)一臺(tái)美國BD公司，型號(hào)為AriaⅡ的流式細(xì)胞儀，并在動(dòng)物醫(yī)學(xué)、動(dòng)物生物技術(shù)專業(yè)的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中率先引入了流式細(xì)胞技術(shù)，旨在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生物學(xué)、FCM理論知識(shí)教學(xué)與學(xué)生動(dòng)手操作能力培養(yǎng)的有效融合。

1 流式細(xì)胞術(shù)原理

流式細(xì)胞儀主要由流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，激光光源及光束形成系統(tǒng)，信號(hào)檢測(cè)、存貯、光電轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和細(xì)胞分選系統(tǒng)5部分組成。

將待測(cè)標(biāo)本制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)不同的熒光染料染色后加入流式上樣管，由氣壓裝置送入流動(dòng)室，樣品在鞘液的的包被下成單行排列，以一定流速經(jīng)過噴嘴進(jìn)入激光聚焦區(qū)，在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光信號(hào)和熒光信號(hào)。散射光信號(hào)包括前向角散射光(Forward Scatter，F(xiàn)SC)及側(cè)向角散射光(Side Scatter，SSC)。FSC主要反映細(xì)胞的大小，SSC主要反映細(xì)胞質(zhì)、胞膜、核膜的折射情況以及細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度。熒光信號(hào)的強(qiáng)弱反映了所測(cè)細(xì)胞表面抗原的強(qiáng)度或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的濃度。光信號(hào)通過波長選擇通透性濾片后，經(jīng)PMT接收轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，再經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，計(jì)算機(jī)對(duì)采集的各種信號(hào)用相應(yīng)的應(yīng)用軟件進(jìn)行分析處理，以一維直方圖、二維、三維散點(diǎn)圖或等高線圖以及數(shù)據(jù)表等形式顯示出來［6-8］。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)部分

2．1 儀器演示

鑒于AriaⅡ型流式細(xì)胞儀既可用于流式分析又可用于細(xì)胞的無菌分選，對(duì)存放環(huán)境要求較高，目前置于吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)室(見圖1)。選修細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的本科生及研究生人數(shù)較多，我們采取儀器現(xiàn)場(chǎng)觀摩、學(xué)生分組輪換形式對(duì)儀器進(jìn)行講解。

圖1 AriaⅡ流式細(xì)胞儀

學(xué)生應(yīng)更換工作服、拖鞋后方可進(jìn)人流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)室。教師先講解流式細(xì)胞儀的組成由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及細(xì)胞分選系統(tǒng)5個(gè)部分，并分別介紹每一部分的具體構(gòu)造及在整個(gè)系統(tǒng)中所起的作用，待分析的標(biāo)本在儀器中經(jīng)過的“路徑”，將流式細(xì)胞儀原理介紹貫穿入各個(gè)系統(tǒng)中，使學(xué)生對(duì)流式細(xì)胞儀有個(gè)整體的感官認(rèn)識(shí)。逐一開啟穩(wěn)壓電源、計(jì)算機(jī)、激光電源進(jìn)入開機(jī)程序，強(qiáng)調(diào)開機(jī)過程中的應(yīng)注意那些問題。運(yùn)行 BD FACSDiva Software軟件并進(jìn)入軟件界面，此部分做重點(diǎn)講解:軟件的組成部分及每一部分的具體作用;流式細(xì)胞術(shù)的常用術(shù)語介紹:FSC、SSC、流式通道、門、A、H、W、CV等;流式結(jié)果的表示形式:單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)點(diǎn)圖或等高線圖、疊加圖，F(xiàn)SC-SSC為物理參數(shù)圖，采用散點(diǎn)圖表示，細(xì)胞染一種熒光，一般用直方圖表示，雙色或多色，常用散點(diǎn)圖或等高線圖表示，當(dāng)然也可以把散射光參數(shù)與熒光參數(shù)隨意組合，并可根據(jù)需要進(jìn)行相互轉(zhuǎn)換［9］;以單色和雙色實(shí)驗(yàn)為例，利用BD公司培訓(xùn)用的熒光微球，現(xiàn)場(chǎng)演示單色和雙色實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的分析方法，包括文件的建立、標(biāo)本的準(zhǔn)備、參數(shù)的設(shè)定、樣品的采集、結(jié)果分析、數(shù)據(jù)的導(dǎo)入導(dǎo)出等;最后進(jìn)行儀器關(guān)機(jī)及日常維護(hù)的講解。通過上述學(xué)習(xí)，學(xué)生對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的理論知識(shí)、儀器的原理及構(gòu)造有了更為深刻、系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的完成奠定了基礎(chǔ)。

2．2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2．2．1 儀器、材料與試劑

流式細(xì)胞儀，生物安全柜，CO2培養(yǎng)箱，低溫高速離心機(jī)，移液器(1mL、200 μL)，槍頭(1 mL、200 μL)，DMEM(Hyclone);pCI-EGFP質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，293T細(xì)胞，lipofectin2000(Invitrogen)，Balb/C 小鼠，F(xiàn)ITCAnti-Mouse CD4(Biolegend)，PE-Anti-Mouse CD8a(Biolegend)，CY5/PE-Anti-Mouse CD3e(Biolegend)。

2．2．2 方法

實(shí)驗(yàn)一:pCI-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后EGFP蛋白的表達(dá)。

(轉(zhuǎn)染方法按lipofectin2000(Invitrogen)進(jìn)行。)

(1)轉(zhuǎn)染前1天將293 T細(xì)胞用無抗生素培養(yǎng)液接種到6孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70% ～80%融合時(shí)即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

(2)轉(zhuǎn)染液的準(zhǔn)備。A液:用無血清培養(yǎng)液稀釋3μg質(zhì)粒至15μL，B液:用無血清培養(yǎng)液稀釋10μL脂質(zhì)體至15μL。輕輕混合兩種液體，室溫放置20 min。

(3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備。細(xì)胞用1．5 mL無血清培養(yǎng)液漂洗2次，再加入2 mL無血清培養(yǎng)液。

(4)轉(zhuǎn)染。將A/B混合液緩慢加到6孔板中，搖勻，37℃培養(yǎng)4 h后，更換10%DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

(5)轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞用胰酶消化，分散后用PBS漂洗2次，并重懸于PBS中，密度為(5～10)×106cells/mL。

(6)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293 T細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)二:小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞類的檢測(cè)

(1)將制備好的脾臟T淋巴細(xì)胞懸液取2×106個(gè)淋巴細(xì)胞于EP管中。

(2)加入1mL的熒光洗液，1 500 r/min離心10 min，洗滌2次。

(3)每管加入FITC-Anti-Mouse CD4單克隆抗體(0．5 mg/mL)、PE-Anti-Mouse CD8a 單克隆抗體(0．2 mg/mL)、CY5/PE-Anti-Mouse CD3e(0．2 mg/mL)的熒光洗液200μL重新懸浮細(xì)胞，混勻后4℃避光孵育30 min。

(4)加入1 mL熒光洗液，1 500 r/min離心10 min，洗滌2次。最后用500μL熒光保存液重懸。

(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。相同方法，同時(shí)分別制備各染色抗體單染對(duì)照管和空白管。

2．2．3 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)一:pCI-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后EGFP蛋白的表達(dá)。

GFP(綠色熒光蛋白)是來自海洋生物水母的一種天然熒光蛋白，它在細(xì)菌、真菌、動(dòng)物和植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)都能夠發(fā)出熒光，這使它成為一種理想的熒光標(biāo)記蛋白。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因是在水母來源的野生型GFP基因的基礎(chǔ)上，替換了影響熒光表達(dá)效率的88個(gè)密碼子中的92個(gè)堿基所構(gòu)建的合成基因，可以顯著提高其在動(dòng)物細(xì)胞中的熒光效能，大大增強(qiáng)了該報(bào)告分子的靈敏度，其激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為507 nm，同時(shí)由于Em值的顯著提高等諸多特性使EGFP非常適用于流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析［10-11］。因此突變型EGFP基因比野生型更適用于作為報(bào)告基因和篩選標(biāo)記，目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域［12］。

圖2為FSC-SSC物理參數(shù)圖，確定待檢測(cè)的細(xì)胞群;圖3為EGFP單參數(shù)直方圖(峰圖)，“P2”門為表達(dá)EGFP的陽性細(xì)胞情況。

圖2 FSC－SSC物理參數(shù)圖

圖3 EGFP單參數(shù)直方圖

實(shí)驗(yàn)二:小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞類的檢測(cè)。

淋巴細(xì)胞是正常機(jī)體免疫系統(tǒng)功能最重要的一類細(xì)胞群。在免疫應(yīng)答過程中，脾臟淋巴細(xì)胞發(fā)育成為功能不同的亞類，各亞類的數(shù)量和功能發(fā)生變化時(shí)，表明機(jī)體的免疫狀態(tài)發(fā)生變化［13］。流式細(xì)胞儀可同時(shí)檢測(cè)一種或幾種淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面抗原，通過不同的淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量的測(cè)定來確定機(jī)體的免疫狀態(tài)［14-15］。

圖4為FSC-SSC物理參數(shù)圖，確定待檢測(cè)的淋巴細(xì)胞群;圖5為CD3+/CD4+雙參數(shù)散點(diǎn)圖;圖6為CD3+/CD8+雙參數(shù)散點(diǎn)圖。Q1:CD4單陽性細(xì)胞;Q2:CD3+/CD4+雙陽性細(xì)胞;Q3:CD3-/CD4-雙陰性細(xì)胞;Q4:CD3+單陽性細(xì)胞;Q1-1:CD8單陽性細(xì)胞;Q2-1:CD3+/CD8+雙陽性細(xì)胞;Q3-1:CD3-/CD8-雙陰性細(xì)胞;Q4-1:CD3+單陽性細(xì)胞。

圖4 FSC－SSC物理參數(shù)圖

圖5 CD3+/CD4+雙參數(shù)散點(diǎn)圖

圖6 CD3+/CD8+雙參數(shù)散點(diǎn)圖

3 結(jié)語

該實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)現(xiàn)了教學(xué)和科研的有機(jī)結(jié)合，既重溫了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，又加深了對(duì)FCM基礎(chǔ)知識(shí)的理解和掌握。從細(xì)胞標(biāo)本的制備到上機(jī)檢測(cè)、結(jié)果分析等一系列步驟中，既培養(yǎng)了學(xué)生動(dòng)手操作能力、科研分析及解決問題的能力，也充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生的積極性，增加了師生之間的互動(dòng)，優(yōu)化了教學(xué)過程，提高了教學(xué)質(zhì)量，取得了滿意的教學(xué)效果。在提高流式細(xì)胞儀利用率的同時(shí)，也最大程度地發(fā)揮了現(xiàn)有儀器設(shè)備的資源優(yōu)勢(shì)和師資特長，使學(xué)生接受了最好的專業(yè)訓(xùn)練。

［1］ 鄧喜林，林躍智，李 蕊，等．流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)上的應(yīng)用及其發(fā)展前景［J］．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40(6):137-140．

［2］ 郭術(shù)?。魇郊?xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用［J］．齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33(5):636-637．

［3］ 劉 濤，張 巍，王鳳陽，等．流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(3):102-105．

［4］ 王淑靜，畢建杰，郝建民．流式細(xì)胞儀在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用［J］．實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2012，10(1):34-36．

［5］ 杜立穎，張麗君．流式細(xì)胞術(shù)新實(shí)驗(yàn)的開發(fā)［J］．實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2004，21(6):17-20．

［6］ 張峻峰，劉道亮，趙占民，等．流式細(xì)胞術(shù)在微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展［J］．食品工程，2010(3):19-22．

［7］ 賈永蕊．流式細(xì)胞術(shù)在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用［J］．中國醫(yī)學(xué)裝備，2010，7(4):4-6．

［8］ 王書奎，周振英．實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)彩色圖譜［M］．上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2004．

［9］ 劉愛平．細(xì)胞生物學(xué)熒光技術(shù)原理和應(yīng)用［M］．合肥:中國科技大學(xué)出版社，2007．

［10］ 魏 欣，張 野，李 軍，等．真核表達(dá)載體pEGFP-claudin-1的構(gòu)建及其在293T細(xì)胞中的表達(dá)［J］．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志．2008，24(5):444-446．

［11］ 谷 雨，李 青，葉 菁，等．EGFP-CIDE-3及 DsRed 1-CIDE-3融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在293T細(xì)胞中的表達(dá)和定位［J］．醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21(9):911-915．

［12］ 徐潔杰，張偉娟，王浩明，等．增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建［J］．四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，42(2):386-388．

［13］ 汪道鑫，虞春華，葉穎俊，等．T淋巴細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30(24):3193-3195．

［14］ 楊 紅．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)25例肺癌患者T淋巴細(xì)胞亞群表型分析［J］．中國實(shí)用醫(yī)藥，2009，26(4):36-37．

［15］ 胡茂志，孟 闖，潘志明，等．流式細(xì)胞術(shù)在活化T淋巴細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30(2):82-85．