吳 瓊，郭 蒙，葉 華，朱宇珍，鄭學(xué)寶

（1.廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)學(xué)院廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524023)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是世界第三大常見惡性腫瘤，CRC可由自發(fā)或慢性炎癥發(fā)展而致。炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是CRC發(fā)生除吸煙、飲食、家族遺傳等因素外的一個致病因素，可以大大增加患CRC的風(fēng)險[1]。慢性炎癥的反復(fù)損傷、修復(fù)、增生、引起基因突變，從而引起細(xì)胞癌變，大約有20%的人癌癥來源于慢性炎癥[2]。結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌(Ulcerative colitis associated colorectal cancer，UCACRC)動物模型的研究，有助于探索復(fù)雜的CRC發(fā)病和發(fā)展的機(jī)制，動物模型已經(jīng)為腫瘤轉(zhuǎn)移及特異性靈敏療法提供了依據(jù)[3]，所以以人類診斷和治療為導(dǎo)向的試驗必須用動物模型做臨床前研究。目前最常用的化學(xué)誘導(dǎo)IBD相關(guān)性CRC癌變的動物模型中，氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate，DSS)誘發(fā)的CRC動物模型可以成功模擬其全過程。本文主要探討AOM/DSS動物模型的造模方法及UC相關(guān)CRC組織學(xué)特征，并探討其主要特點以及診斷癌變途徑的研究進(jìn)展。

1 AOM/DSS動物模型

CRC的發(fā)生發(fā)展是一個長期的過程，正常上皮細(xì)胞通過隱窩異常發(fā)展為腺瘤進(jìn)而發(fā)展為原位癌。CRC模型已經(jīng)可以模擬人類的腫瘤病因和病理學(xué)改變，無論是體內(nèi)還是體外模型均可以反映CRC發(fā)展的每一個階段。AOM/DSS模型是使用最廣泛的小鼠模型，AOM是一種化學(xué)致癌劑1,2-二甲基肼(1,2-dime-thylhydrazin，DMH)作用的DNA烷基化產(chǎn)物，可以由腹腔注射并經(jīng)由膽汁代謝，由菌群代謝進(jìn)一步激活A(yù)OM使其致癌[4]，AOM較DMH相比致癌效果增強(qiáng)且更加穩(wěn)定。多次腹腔注射AOM導(dǎo)致在結(jié)腸遠(yuǎn)端產(chǎn)生腫瘤，其組織學(xué)特征類似于人類的CRC，要模擬CRC需要AOM與DSS結(jié)合造模。DSS為化學(xué)致炎劑，動物飲用含有DSS的飲水可以造成炎癥性腸病模型，其病理學(xué)改變類似于人類潰瘍性結(jié)腸炎。

AOM/DSS模型多應(yīng)用于CRC發(fā)病機(jī)理的研究、預(yù)防CRC化學(xué)藥物的研究、致癌環(huán)境的檢測[5]以及腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險研究[6]。實驗性結(jié)直腸癌的發(fā)生主要是由AOM/DSS模型誘發(fā)的異常隱窩病灶(Aberrant crypt foci，ACF)和腺瘤癌變形成，均依賴于劑量、誘導(dǎo)方式、誘導(dǎo)周期、根據(jù)不同的延長時間形成癌變[7]。Suzuki等[8]報道，選用 Balb/c、C2H/HeN、C57BL/6N、DBA/2N四種品系小鼠，在造模第一天給予單次腹腔注射AOM(10 mg/kg)，第二天給予含有1%的DSS自由飲用5 d，之后不做任何處理，至到實驗第126天結(jié)束實驗，觀察到AOM/DSS模型在不同品系小鼠中結(jié)腸癌的發(fā)生敏感性存在差異；在4個近交系小鼠進(jìn)行造模研究，其中結(jié)腸腺癌發(fā)生率在Balb/c小鼠中為100%，在C57BL/6N小鼠中為50%，在C3H/HeN小鼠中為29%，在DBA/2N小鼠中為20%。

AOM/DSS模型通過炎癥和免疫組化的硝基酪氨酸陽性表達(dá)陽性率判斷小鼠品系對其敏感度為：Balb/c＞C57BL/6N＞C3H/HeN＞DBA/2N。 最 近 研 究AOM/DSS模型造模方法相關(guān)報道如表1[8-15]。Tian等[12]和Shang等[13]報道，AOM/DSS模型可以導(dǎo)致其結(jié)腸腺癌發(fā)生率接近100%。

表1 AOM/DSS模型方法

2 在炎癥相關(guān)癌癥研究中AOM/DSS模型的應(yīng)用

腫瘤發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，包括啟動、促進(jìn)和發(fā)展。細(xì)胞癌變涉及到腫瘤細(xì)胞的變異、侵襲及增殖。促進(jìn)腫瘤形成需要持續(xù)誘導(dǎo)和刺激，以及早期致癌物質(zhì)對凋亡的抑制。在腫瘤形成初期，隨著癌細(xì)胞增殖成纖維細(xì)胞也會轉(zhuǎn)移到病灶處，發(fā)揮有益功能的細(xì)胞開始倒轉(zhuǎn)過來對抗機(jī)體，通過刺激炎癥而促進(jìn)腫瘤生長[16]。炎癥微環(huán)境可以影響腫瘤的發(fā)生和腫瘤形成[17]，從臨床前研究和臨床研究通過潛在分子機(jī)制已經(jīng)證明炎癥持續(xù)發(fā)生會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，是發(fā)生癌變的高危因素[18]。流行病學(xué)研究顯示，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)的炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)發(fā)生癌變的機(jī)制為：發(fā)炎黏膜增生性病變-不典型增生-癌變[19]。由炎癥誘發(fā)的癌變機(jī)制包括：炎癥誘導(dǎo)活性氧和活性氮產(chǎn)生、誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定、基因突變后的倍性、增強(qiáng)細(xì)胞增殖、基因異常表達(dá)、抗凋亡、腫瘤的血管可以新生以至于更具侵略性、穿透基底膜導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。這些機(jī)制可以直接或是間接的通過損傷重要的細(xì)胞成分(例如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。炎癥已經(jīng)成為癌癥的第七大特征，慢性炎癥的持續(xù)刺激是多種腫瘤產(chǎn)生的關(guān)鍵原因。

AOM/DSS模型在炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌實驗中具有重要意義，它是在腫瘤發(fā)生率相對較低的前提下，由標(biāo)準(zhǔn)的UC模型通過多周期DSS誘導(dǎo)和延長造模時間完善而制定。在AOM/DSS誘導(dǎo)3～4周后，小鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)彌散性炎癥，上皮隱窩異常，固有層呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)并有大量炎癥細(xì)胞表達(dá)(淋巴細(xì)胞，漿細(xì)胞)。研究中有大量肥大細(xì)胞遷移，可以發(fā)現(xiàn)其周圍或是在其內(nèi)部有癌變[20]。觀察人類結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的特征主要表現(xiàn)在免疫細(xì)胞浸潤，包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞(包括CD8+、CD4+效應(yīng)T細(xì)胞和CD4+、CD25+T細(xì)胞)[21]。Garrett等報道，樹突狀細(xì)胞為T-Bet(-/-)RAG2(-/-)UC模型中炎癥癌變的細(xì)胞感受器[22]。Mantovani等[23]報道，在AOM/DSS模型中形成腫瘤的第一階段，可以觀察到誘發(fā)癌癥的兩個條件——結(jié)腸炎和遺傳/后生遺傳在特定的微環(huán)境協(xié)調(diào)下，有助于促進(jìn)腫瘤形成。在AOM/DSS模型中促進(jìn)腫瘤生長的兩個條件，炎癥內(nèi)在途徑為炎癥相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞基因改變，外在途徑為在腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)炎癥條件改變[23]。

在AOM/DSS模型中炎癥促癌發(fā)生關(guān)鍵因子包括主轉(zhuǎn)錄因子(例如NF-κB和STAT3)、炎性細(xì)胞因子(TNF-α，IL-6)、COX-2和特定趨化因子。用于檢查炎癥介質(zhì)包括IL-10、TCF-β、toll樣受體(TLR)，IL-1受體抑制劑TIR8，趨化因子誘餌受體和清道夫受體D6。

3 在癌癥研究中AOM/DSS模型的應(yīng)用

大量實驗已經(jīng)證明AOM/DSS動物模型與人類CRC的發(fā)病機(jī)制相似。由于腫瘤誘導(dǎo)劑(AOM)和腫瘤促進(jìn)劑(DSS)的協(xié)同反應(yīng)。AOM/DSS模型較僅用AOM或DSS模型相比，可以呈現(xiàn)急性炎癥的最初階段和較短的潛伏期來再現(xiàn)CRC的發(fā)生機(jī)制。例如，嚙齒動物自由飲用DSS，廣泛應(yīng)用于IBD模型，通過DSS誘導(dǎo)CRC需要長時間飲用或多周期飲用，并且腫瘤發(fā)病率較低。

Tanaka等[20]報道，AOM/DSS模型是給予Balb/c小鼠單次腹腔注射AOM(10 mg/kg)，自由飲用2%DSS一個循環(huán)，利用這種造模方法有多發(fā)性結(jié)腸腫瘤產(chǎn)生。DSS溶于飲水中其毒性作用于結(jié)腸上皮細(xì)胞，飲用DSS第一周其特征表現(xiàn)在小鼠體重減輕、血便。但是，這些現(xiàn)象在AOM/DSS誘導(dǎo)5周后，明顯減輕。這個模型中的癌癥發(fā)展密切反映人類腫瘤發(fā)展模式。小鼠給予AOM/DSS誘發(fā)的腫瘤準(zhǔn)確的概括了被觀察到的人類CRC發(fā)病機(jī)制。例如，腫瘤多發(fā)于結(jié)腸遠(yuǎn)端，這也是人類自發(fā)CRC的主要位置。腫瘤先由息肉狀成長，并且其病理學(xué)特征與人類CRC相似。但是，AOM誘導(dǎo)的腫瘤往往缺乏黏膜侵襲性[24]。通過微觀和宏觀技術(shù)分析淋巴結(jié)和其他外周器官可能為考慮用于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究。

CRC發(fā)病是一個多因素多步驟的過程，這個過程是由正常隱窩形成ACF，隱窩裂變增殖形成微腺瘤，微腺瘤發(fā)展成肉眼可見腺瘤、腺瘤性息肉，最終癌變形成腺癌。因此，在形態(tài)和遺傳學(xué)研究，這個多步驟過程為腺瘤癌變順序[25]。在近交系Balb/c和遠(yuǎn)交系ICR-1易感小鼠中，AOM/DSS模型能有效地高再現(xiàn)性這個多步驟腫瘤發(fā)生過程。雄性小鼠中，從開始致敏到12周，結(jié)腸黏膜潰瘍導(dǎo)致結(jié)腸炎，不典型增生，管狀腺瘤，有80%～100%小鼠出現(xiàn)3～10個肉眼可見腫瘤[26-27]。利用固定好的結(jié)腸切片，通過亞甲基藍(lán)染色可觀察到結(jié)腸黏膜表面的結(jié)腸隱窩是否異常。

Roncucci等[28]報道在AOM/DSS誘導(dǎo)的3～4周可以觀察到深染部分為偶然的，異常大的略凸起的“異常隱窩”。AOM/DSS誘導(dǎo)的腫瘤通常是由T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞浸潤結(jié)腸壁，腺瘤增生惡性癌變?yōu)橄侔?。AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸中部和遠(yuǎn)端可觀察到腫瘤呈結(jié)節(jié)狀、息肉狀和絨毛狀。Ward等[29]報道，這些腫瘤是管狀腺瘤或中度分化管狀腺瘤。Tanaka等[20]報道，AOM/DSS誘導(dǎo)20周時，其管狀腺癌發(fā)生率為100%，多發(fā)性腺癌發(fā)生率為38%。顯微鏡下觀察，所形成的腫瘤特性是結(jié)腸上皮內(nèi)形成的腫瘤，成瘤過程是從息肉的周邊和非增生結(jié)腸上皮開始低度增生，到形成腫瘤的中央部位和黏膜下層浸潤的高度增生。Pascal等[30]報道結(jié)腸黏膜發(fā)生的不典型增生多為輕度和重度不典型增生。輕度不典型增生，細(xì)胞核細(xì)長，排列較緊密，出現(xiàn)假復(fù)層，但細(xì)胞核極性正常，杯狀細(xì)胞正?；蚵杂袦p少；中度不典型增生，細(xì)胞核更加細(xì)長，排列緊密，假復(fù)層增多，但細(xì)胞極性仍正常，杯狀細(xì)胞減少；重度不典型增生，細(xì)胞核增大，為圓形或卵圓形，核染色質(zhì)變粗，并出現(xiàn)明顯核仁，排列緊密，出現(xiàn)共壁、篩網(wǎng)結(jié)構(gòu)，或腺管上皮細(xì)胞增生，連接成網(wǎng)狀，核極性紊亂，存在眾多有絲分裂，杯狀細(xì)胞明顯減少。若出現(xiàn)上述重度不典型增生現(xiàn)象可以確定腺瘤已癌變，有時腺瘤的細(xì)胞和組織學(xué)還處在不典型增生階段時，但腫瘤組織已突破黏膜肌層向黏膜下層浸潤并向周圍纖維組織發(fā)展，也可以確定腺瘤已癌變。

4 展望

在過去的二十年中，CRC小鼠模型提供了IBD向CRC發(fā)展相關(guān)的病理組織學(xué)和分子學(xué)機(jī)制，有助于我們了解人類IBD向CRC發(fā)病的機(jī)制。在動物模型中，化學(xué)誘導(dǎo)CRC小鼠模型已被證明是非常有價值的，而其中AOM/DSS模型為更加穩(wěn)定的重要工具。AOM/DSS模型表明在短時間內(nèi)動物受影響且腫瘤發(fā)病率很高，可以預(yù)見和監(jiān)測的腫瘤發(fā)展，可以再現(xiàn)人類CRC發(fā)生發(fā)展的過程。在AOM/DSS模型的平臺上，開發(fā)CRC的化學(xué)預(yù)防藥物，觀察其診斷、預(yù)后和預(yù)測指標(biāo)，在臨床前應(yīng)用是非常有價值的。將來對AOM/DSS模型進(jìn)一步完善，在開發(fā)新的和更復(fù)雜的分子工具與遺傳學(xué)結(jié)合應(yīng)用，可能讓我們來重新定義CRC相關(guān)疾病。利用該模型的完善，更有助于觀察及控制癌前病變研究。

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