蘇艷，王世民，邵俊高，張寶江，韋海娜

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

Kozak序列對(duì)金黃色葡萄球菌黏附因子FnBPA-A DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的影響

蘇艷，王世民，邵俊高，張寶江，韋海娜

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

蘇艷, 王世民, 邵俊高, 等. Kozak序列對(duì)金黃色葡萄球菌黏附因子FnBPA-A DNA疫苗誘導(dǎo)的小鼠的免疫應(yīng)答的影響.生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(4): 458?465.

Su Y, Wang SM, Shao JG, et al. Effect of Kozak sequence on mice DNA vaccine immunization ofStaphylococcus aureusadhesion fibronectin-binding protein FnBPA-A. Chin J Biotech, 2013, 29(4): 458?465.

黏附因子FnbpA (纖連蛋白結(jié)合蛋白A，F(xiàn)ibronectin binding protein A) 是金黃色葡萄球菌表面的蛋白質(zhì)成分，是該菌感染早期最重要的致病因子，可促進(jìn)其對(duì)寄主組織的侵入，也是一個(gè)有潛力的免疫靶標(biāo)。將牛乳源金黃色葡萄球菌中FnBPA基因的A功能區(qū)克隆至真核表達(dá)載體中，分別構(gòu)建含Kozak序列和不含Kozak序列的FnBPA-A基因真核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定測(cè)序正確后，免疫C57BL/6小鼠檢測(cè)其抗體水平和淋巴細(xì)胞增殖情況，并對(duì)各組小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)的結(jié)果表明Kozak修飾的重組DNA在血清抗體效價(jià) (P＜0.05)和免疫保護(hù)率方面均優(yōu)于不含Kozak序列的重組DNA，在刺激淋巴細(xì)胞增殖方面Kozak修飾的重組DNA的刺激效果雖然也高于不經(jīng)修飾的重組DNA，但是差異不顯著 (P＞0.05)。根據(jù)總體的免疫效果來(lái)看，Kozak序列對(duì)增強(qiáng)FnBPA的重組DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答起了不容忽視的作用。

金黃色葡萄球菌，黏附因子FnBPA，Kozak序列，重組DNA疫苗，免疫應(yīng)答

由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎已引起人們的廣泛關(guān)注，目前對(duì)該菌的研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌表面可表達(dá)一些特異性蛋白，又稱(chēng)黏附因子，能促進(jìn)與宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和可溶血漿蛋白的粘附[1]。其中纖連素結(jié)合蛋白(Fibronectin-binding proteins，F(xiàn)nBPA) 是重要的黏附因子之一[2]，能夠介導(dǎo)金黃色葡萄球菌結(jié)合于細(xì)胞表面的纖維連結(jié)素，幾乎所有的金黃色葡萄球菌都有纖連蛋白結(jié)合蛋白FnBPA[3]，抑制其活性后可切斷金黃色葡萄球菌早期感染途徑。已有研究證明，抑制該菌的黏附功能可部分保護(hù)試驗(yàn)動(dòng)物抵抗金黃色葡萄球菌的感染[4-5]，因此該分子被認(rèn)為是金黃色葡萄球菌粘附并侵入乳腺細(xì)胞必須的毒力因子[6]，是感染的關(guān)鍵，也是一個(gè)極好的免疫靶位，目前已被視為新型預(yù)防和治療性疫苗的潛在靶位[7]。

目前 FnBPA蛋白最受關(guān)注的功能區(qū)主要有A區(qū)與 D區(qū)。A區(qū)能夠結(jié)合機(jī)體纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)g)[8]。D 區(qū)是能和纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n) 結(jié)合的11或12個(gè)重復(fù)序列[9]。本研究選取了FnBPA A區(qū)的N2、N3亞區(qū)和1、2兩個(gè)高結(jié)合力的重復(fù)序列為目的片段將其克隆至真核表達(dá)載體中，通過(guò)檢測(cè)其在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)和免疫效率，評(píng)估其作為DNA疫苗靶標(biāo)的價(jià)值。

Kozak序列是很多哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能提高基因表達(dá)的一個(gè)上游調(diào)控元件[10]。以往的研究表明，該序列對(duì)增強(qiáng)外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平有重要的作用[11-12]。DNA疫苗在真核細(xì)胞中的表達(dá)主要受轉(zhuǎn)錄、翻譯兩個(gè)水平的調(diào)控，為提高FnBPA-A基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)量，提高其免疫后的免疫效果，我們構(gòu)建了基于 FnBPA-A基因帶有Kozak序列和不帶該序列的重組DNA真核表達(dá)載體，并對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行免疫，從抗體水平、淋巴細(xì)胞增殖水平和免疫保護(hù)效率方面比較了兩者刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)率的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、酶及主要試劑

含有FnBPA-A基因的PV-SFn由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；LATaqDNA聚合酶、pMD 18-T載體、DNA Marker、中等分子量蛋白 Marker均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)于Omega公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒 GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit，PM Western Midview Western 中分子量蛋白 Marker購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；高效真核轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.1.2 菌株及試驗(yàn)動(dòng)物

菌株Staphylococcussp. GW-1由本實(shí)驗(yàn)室從乳腺炎奶樣中分離并鑒定，大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，5～7周齡的C57BL/6小鼠 (18～20g)購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體PV-KFn與PV-SFn的構(gòu)建

根據(jù)FnBPA-A基因序列和Kozak序列的特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，并在上下游引物加入BamHⅠ和XhoⅠ兩酶切位點(diǎn)，構(gòu)建真核表達(dá)載體PV-KFn。具體為：koF (5￠?3￠)：CGG GAT CCG GAA ATG GCT AAC GTT AAT CAT AT，koR (5￠?3￠)：GCG CTC GAG CTA TTC AAT GTA TCC GTC AAC。反應(yīng)體系：模板 0.5 μL，10×LA PCR 緩沖液 5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 5 μL，上游引物(50 pmol/μL) 0.5 μL，下游引物 (50 pmol/μL)0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.3 μL，滅菌去離子水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min ，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。測(cè)序正確后加Kozak序列和不加該序列的重組表達(dá)載體分別命名為PV-KFn和PV-SFn。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)

構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液與5×SDS緩沖液混合煮沸處理，純化蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)好的膜用2%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜。用濃度為1∶800的一抗37 ℃孵育2 h，PBST洗膜5次，用HRP標(biāo)記1∶500的羊抗兔IgG 37 ℃溫育1 h，PBST洗膜5次，DAB顯色液顯色后記錄結(jié)果。

1.2.3 試驗(yàn)小鼠的DNA免疫

對(duì)試驗(yàn)小鼠進(jìn)行分組 (試驗(yàn)組 PV-KFn 12只，試驗(yàn)組PV-SFn 12只，空載體組12只和空白對(duì)照組12只)，免疫前采陰性血清，重組質(zhì)粒DNA混勻，后腿肌肉注射100 μg/只。3周后進(jìn)行第2次免疫，每次免疫后2周采血分離血清，檢測(cè)血清樣品的抗體效價(jià)。

1.2.4 試驗(yàn)小鼠的體液免疫應(yīng)答檢測(cè)

用間接 ELISA方法對(duì)免疫小鼠血清進(jìn)行抗體效價(jià)的檢測(cè)，具體操作如下：用純化 FnBPA蛋白作包被抗原，4 ℃包被過(guò)夜。鼠血清初始1∶100倍稀釋?zhuān)S后進(jìn)行倍比稀釋至不同濃度。將稀釋好的血清作一抗37 ℃溫育2 h，PBST洗滌5次。以1∶4 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作二抗，37 ℃溫育1 h后，PBST洗滌5次，TMB顯色液顯色 30 min，2 mol/L硫酸終止，檢測(cè)OD450值。

1.2.5 抗體對(duì)金黃色葡萄球菌黏附纖連素結(jié)合蛋白的抑制

用 50 μL 10 μg/mL 纖維蛋白原 (Fibrinogen，F(xiàn)g) 做包被抗原4 ℃包被過(guò)夜，熱滅活的金黃色葡萄球菌 GW-1懸液濃度調(diào)整為 2×108個(gè)/mL，與倍比稀釋的免疫鼠血清 (1∶100至 1∶800)總體積為100 μL，37 ℃溫育1 h。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。包被過(guò)的96孔板封閉后加入與抗體反應(yīng)過(guò)的菌懸液，37 ℃溫育2 h。兔抗金葡菌GW-1血清 (1∶700) 作一抗37 ℃溫育2 h，以1∶4 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作二抗，37 ℃溫育1 h后，PBST洗滌3次，進(jìn)行TMB顯色及檢測(cè)OD450值。

1.2.6 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

對(duì)二次免疫90 d后的小鼠無(wú)菌取脾臟，無(wú)菌將小鼠脾制成脾細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為 2×106個(gè)/mL，于96孔板中加100 μL/孔，每只小鼠為9孔，其中3孔為ConA刺激組，ConA終濃度為10 μg/mL，3孔為 FnBPA-A 刺激組，加入FnBPA-A蛋白，3孔為正常脾細(xì)胞組。37 ℃培養(yǎng)52 h左右，加入MTT終濃度1 g/L，于振蕩器上混勻，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，加入150 μL DMSO終止反應(yīng)，充分混勻，靜置數(shù)分鐘后測(cè)OD570值，計(jì)算刺激指數(shù)(SI)，計(jì)算公式為：SI=A/B，A為刺激組OD570值，B為正常組脾細(xì)胞OD570值。

1.2.7 免疫小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)

C57BL/6小鼠二免90 d后對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，以最小致死量7×109CFU的金黃色葡萄球菌GW-1腹腔注射小鼠，每組6只，同時(shí)設(shè)未免疫和空載體對(duì)照組，攻毒后連續(xù)觀察7 d，記錄每組試驗(yàn)鼠的發(fā)病和死亡情況，計(jì)算免疫保護(hù)效率。

2 結(jié)果

2.1 重組載體的酶切鑒定

各重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖 1所示，電泳結(jié)果表明，在1 700 bp左右得到了DNA片段 (和預(yù)期大小相符)。

2.2 Western blotting分析重組蛋白

Western blotting的結(jié)果表明 (圖2)，2種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后均能表達(dá)出分子量為63 kDa左右的FnBPA-A蛋白。

圖1 PV-KFn和PV-SFn重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖Fig. 1 Identification of recombinant plasmid PV-KFn and PV-SFn by enzyme digestion. M: DL15000 marker;1: PVAX-1 vector; 2: PV-KFn; 3: PV-SFn.

圖2 Western blotting分析BHK-21細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白Fig. 2 Western blotting analysis of expressed target protein in BHK-21 cell. M: marker; 1: PV-SFn recombinant plasmid; 2: PV-KFn recombinant plasmid;3: PVAX-1 empty vector.

2.3 重組質(zhì)粒免疫小鼠后的抗體效價(jià)

重組質(zhì)粒免疫小鼠后，血清中抗體效價(jià)的變化見(jiàn)圖 3。與空載體對(duì)照組相比，初次免疫后PV-SFn重組質(zhì)粒組與空載體對(duì)照組的抗體水平幾乎持平，PV-KFn重組質(zhì)粒組升高不明顯，二次免疫后PV-KFn重組質(zhì)粒組均比空載體對(duì)照組的抗體水平明顯升高 (P＜0.01)。且 PV-KFn抗體水平高于PV-SFn重組質(zhì)粒組 (P＜0.05)。表明Kozak序列對(duì)該重組DNA在體內(nèi)的表達(dá)有正調(diào)控的作用，導(dǎo)致了相應(yīng)抗原在動(dòng)物體內(nèi)誘生的抗體水平的升高。各組實(shí)驗(yàn)小鼠抗體OD450檢測(cè)后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 抗體對(duì)纖維蛋白原黏附的抑制作用

為驗(yàn)證免疫后的血清對(duì)金黃色葡萄球菌黏附功能的影響，我們將免疫后血清與熱滅活的菌體作用后檢測(cè)其對(duì)菌體黏附功能的影響。如圖4所示，與空載體和空白對(duì)照的血清相比，在相同的血清稀釋度下，F(xiàn)nBPA-A免疫后的鼠血清可部分抑制金黃色葡萄球菌GW-1對(duì)纖維蛋白原的黏附作用。隨血清稀釋度的增加，抑制作用逐漸減弱。PV-KFn免疫后的血清抗體對(duì)纖維蛋白原黏附作用的抑制作用大于PV-SFn，但差異不顯著。

圖3 PV-KFn及 PV-SFn重組質(zhì)粒免疫小鼠血清抗體效價(jià)的變化Fig. 3 Serum antibody level of mouse immunized with PV-KFn and PV-SFn recombinant plasmid. ns: P>0.05;*: P<0.05; **: P<0.01.

圖4 PV-KFn和 PV-SFn免疫后的小鼠血清抗體對(duì)金黃色葡萄球菌GW-1黏附作用的抑制結(jié)果Fig. 4 Inhibition of bacterial GW-1 adhesion by antibodies after immunizing mice with PV-KFn and PV-SFn recombinant plasmids. ns: P>0.05; *: P<0.05;**: P<0.01.

2.5 重組質(zhì)粒免疫小鼠后的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果

用所構(gòu)建的等量不同重組質(zhì)粒免疫小鼠 2次，二免90 d后，對(duì)脾臟T淋巴細(xì)胞的MTT檢測(cè)所得的刺激指數(shù) (Stimulation index，SI) 如圖5所示，MTT試驗(yàn)的結(jié)果顯示PV-KFn比PV-SFn重組質(zhì)粒組更能刺激機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞的增殖。

圖 5 PV-KFn和 PV-SFn免疫后脾臟 T淋巴細(xì)胞MTT結(jié)果Fig. 5 MTT analysis of spleen T lymphocyte after immunizing with PV-KFn and PV-SFn recombinant plasmids. ns: P>0.05; *: P<0.05; **: P<0.01.

2.6 不同重組體免疫小鼠的免疫保護(hù)率

二次免疫接種后90 d，用保存的牛乳源金黃色葡萄球菌菌株GW-1進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)7 d的觀察，PV-SFn分泌組免疫保護(hù)率為 40%；PV-KFn組的免疫保護(hù)率為60%；空白組和對(duì)照組小鼠24 h全部死亡。表明PV-KFn組的免疫保護(hù)率優(yōu)于PV-SFn分泌組。

3 討論

FnBPA (Fibronectin binding protein A) 是金黃色葡萄球菌重要的毒力因子之一[13]，基于細(xì)菌表面蛋白的粘附機(jī)制研制的抗金黃色葡萄球菌核酸疫苗[14]，被認(rèn)為是有廣闊研究前景的疫苗[15]，可望通過(guò)阻斷金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的粘附過(guò)程來(lái)預(yù)防乳腺炎的發(fā)生。但是當(dāng)前以 FnBPA為靶基因研制的核酸疫苗雖有一定的效果，還需嘗試多種方法提高核酸疫苗免疫效果[16]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì) FnBPA的表達(dá)和免疫方面的研究多集中在D區(qū)序列，我們將對(duì)FnBPA的A區(qū)序列[17](FnBPA-A) 的免疫原性進(jìn)行探索。

真核生物蛋白表達(dá)調(diào)控除了一些上游控制元件和一些因子參與外，和該蛋白起始密碼子AUG周?chē)膲A基種類(lèi)也有很大關(guān)系。美國(guó)學(xué)者Kozak通過(guò)對(duì)699條脊椎動(dòng)物cDNA 5￠非編碼區(qū)4種堿基分布概率的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究分析發(fā)現(xiàn)并得出了著名的“Kozak規(guī)則”[12,18]。當(dāng)一個(gè)基因起始密碼子周?chē)膲A基符合Kozak規(guī)則或由于突變、人為原因改變而符合Kozak規(guī)則時(shí)，該蛋白表達(dá)量會(huì)有相應(yīng)提高，杜明媚等用EGFP作為對(duì)象的研究結(jié)果證明了這點(diǎn)[11-12]。

外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)主要受到轉(zhuǎn)錄、翻譯兩個(gè)水平的調(diào)控。商品化構(gòu)建的真核表達(dá)載體大多會(huì)采用較強(qiáng)的啟動(dòng)子，使其轉(zhuǎn)錄水平受到較強(qiáng)的調(diào)控。對(duì)于我們用真核表達(dá)載體構(gòu)建的質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，表達(dá)外源基因時(shí)增強(qiáng)翻譯水平表達(dá)就顯得尤其重要。此前我們已對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析[19]，在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)將目的基因起始密碼子周?chē)鷫A基經(jīng) Kozak規(guī)則修飾，成功構(gòu)建PV-KFn真核表達(dá)質(zhì)粒，期望在免疫接種該 DNA疫苗后可從翻譯水平提高FnBPA的表達(dá)并進(jìn)而提高動(dòng)物機(jī)體的抗體水平和免疫保護(hù)率。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)帶有 Kozak序列的重組質(zhì)粒PV-KFn質(zhì)粒和不帶該序列的重組質(zhì)粒 PV-SFn免疫后結(jié)果的對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)雖然不帶Kozak序列的重組質(zhì)粒 PV-SFn具有一定的抗體誘生能力，但與PV-KFn組相比，無(wú)論是抗體水平、攻毒保護(hù)率方面都差一些。研究證明[20]當(dāng) Kozak序列用于真核基因表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)，可顯著提高細(xì)胞表達(dá)蛋白的水平且不影響目的蛋白的性質(zhì)和功能。研究結(jié)果進(jìn)一步從免疫動(dòng)物的角度證明，Kozak序列對(duì)增強(qiáng)基于FnBPA的重組質(zhì)粒誘導(dǎo)的體液免疫方面及攻毒保護(hù)力方面都會(huì)產(chǎn)生影響。該結(jié)果對(duì)于今后DNA疫苗的設(shè)計(jì)及提高其免疫保護(hù)效率等方面具有一定的參考價(jià)值。

[1]Patti JM, Allen BL, McGavin MJ. MSRAMM-mediated adherence of microorganisms to host tissues. Annu Rev Microbiol, 1994, 48: 585?617.

[2]Middleton, John R.Staphylococcus aureusantigens and challenges in vaccine development. Vaccine,2008, 7(6): 805?815.

[3]Zhou H, Li HP, The progress ofStaphylococcus aureussurface proteins. Lett Biotechnol, 2004,15(1): 73?75 (in Chinese).

周宏, 李韓平. 金黃色葡萄球菌表面蛋白研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通訊, 2004, 15(1): 73?75.

[4]Foster TJ, Hookm. Surface protein adhesins ofStaphylococcus aureus. Trends Microbiol, 1998,6(12): 484?488.

[5]Shkreta L, Talbota BG, Diarra S, et al. Immune responses to a DNA/ protein vaccination strategy againstStaphylococcus aureusinduced mastitis in dairy cows. Vaccine, 2004, 23(1): 114?126.

[6]Hauck Cr, Ohlsen K. Sticky connections:extracellular matrix protein recognition and integrin-mediated cellular invasion byStaphylococcus aureus. Curr Opin Microbiol, 2006,9(1): 5?11.

[7]Fitzgerald JR, Hartigan PJ. Molecular population and virulence factor analysis ofStaphylococcus aureusfrom bovine intramammary infection. J Appl Microbiol, 2000, 88:1028?1035.

[8]Keane FM, Loughman A, Valtulina V, et al.Fibrinogen and elastin bind to the same region within the A domain of fibronectin binding protein A, an MSCRAMM ofStaphylococcus aureus. Mol Microbiol, 2007, 63(3): 711?723.

[9]Fan X, Hao YQ, Zhang AR, construction and prokaryotic expression of the co-expression plasmid with FnBPB-ClFA gene encodingStaphylococcus aureusadhesion. Chin Vet Sci,2011, 41(2): 173?177 (in Chinese).

范鑫, 郝永清, 張愛(ài)榮, 等. 金黃色葡萄球菌黏附素 FnBPB-ClFA共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與原核表達(dá). 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2011, 41(2): 173?177.

[10]Petty AP, Dick CL, Lindsey JS. Translation of an atypical human cDNA requires fidelity of apurine-pyrimidine repeat region and recoding.Gene, 2008, 414(1/2): 49?59.

[11]Du MM, Ye L, Liu JW, et al. Enhancement of GFP Expression by Kozak Sequence +4G in HEK293 Cells. Chin J Biotech, 2008, 24(3): 491?494 (in Chinese).

杜明梅, 葉玲, 劉建偉, 等. Kozak序列+4G提高綠色熒光蛋白在 HEK293 細(xì)胞中的表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24(3): 491?494.

[12]Wang HZ, Wang XG, Zhai L. Construction of eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)+KG containing green fluorescent protein and its expression in HeLa cell. Biotechnol Bull, 2010, 1:188?192 (in Chinese).

王洪振, 王曉光, 翟雷. 真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)+KG的構(gòu)建及在 HeLa細(xì)胞中的表達(dá). 生物技術(shù)通報(bào), 2010, 1: 188?192.

[13]Mamo W, Jonsson P, Flock JI, et al. Vaccination againstStaphylococcus aureusmastitis:immunological response of mice vaccinated with fibronectin binding protein (FnBP-A) to challenge withS. aureus. Vaccine, 1994, 12(11): 988?992.

[14]Shinji H, Yosizawa Y, Tajima A, et al. Role of fibronectinbinding proteins A and B inin vitrocellular infections and in vivo septic infections byStaphylococcus aureus. Infec Immun, 2011, 79:2215?2223.

[15]Hu C, Gong R, Guo AZ, et al. Protective effect of ligand-binding domain of fibronectin-binding protein on mastitis induced byStaphylococcus auresin mice. Vaccine, 2010, 28: 4038?4044.

[16]Muruganandam M. Engineered plasmid DNA vaccine forStaphylococcus aureus. Int J Biol Technol, 2011, 2(1): 7?10.

[17]Zhang XX, Shi QH, Wang SM, et al. Clone and sequence analysis of FnbpA gene ofStaphylococcus aureusisolated from Xinjiang dairy cow with subclinical mastitis. J Xinjiang Agri Univ, 2010, 33(5): 422?426 (in Chinese).

張向新, 石慶華, 王世民, 等. 新疆奶牛乳腺炎致病性金黃色葡萄球菌FnbpA基因的克隆與序列分析. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 33(5): 422?426.

[18]Kozak M. An analysis of 5’- noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucl Acids Res, 1987, 15(20): 8125?8148.

[19]Wang SM, Su Y. Bioinformatic analysis and design of staphylococcus aureus fibronectin-binding protein A (FnBPA) signal peptide and its eukaryotic secret expression. J Xinjiang Agri Univ,2012, 35(3): 212?216 (in Chinese).

王世民, 蘇艷. 金黃色葡萄球菌纖連結(jié)合蛋白信號(hào)肽的生物信息學(xué)分析及其真核分泌表達(dá). 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 35(3): 212?216.

[20]Zhang Q, Li MC, Sun Y, et al. Heteroexpression ofRhizopus arrhizusΔ6-fatty acid desaturase gene inPichia pastoris. Chin J Biotech, 2005, 21(6):871?877 (in Chinese).

張琦, 李明春, 孫穎, 等. 少根根霉 Δ6-脂肪酸脫氫酶基因在畢赤酵母中的表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào),2005, 21(6): 871?877.

September 23, 2012; Accepted: January 14, 2013

Yan Su. Tel: +86-991-8762704; E-mail: 2006au@163.com

Effect of Kozak sequence on mice DNA vaccine immunization ofStaphylococcus aureusadhesion fibronectin-binding protein FnBPA-A

Yan Su, Shimin Wang, Jungao Shao, Baojiang Zhang, and Haina Wei
College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi830052,Xinjiang,China

Fibronectin-binding protein (FnBPA) is a protein that expresses on cell surface ofStaphylococcus aureusduring early stage of infection. FnBPA was capable of promotingStaphylococcus aureusto invade cells and was viewed as a potential immune target. Based on the FnBPA-A gene two recombinant expression vectors with or without Kozak sequence were constructed. After identified and confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing they were used to immunize C57BL/6 mice. Then induced antibody titer, T lymphocyte proliferative response and experiment mice challenge test were measured. Our result indicates that humoral immune responses and challenge experiment induced by recombinant DNA with Kozak sequence were better than those without Kozak sequence (P<0.05). For T lymphocyte proliferative response the induced effect of recombinant DNA with Kozak sequence was higher than that without Kozak sequence, but there was no significant difference (P>0.05). We conclude that Kozak sequence could play an important role in immune response induced by FnBPA-A recombinant DNA.

Staphylococcus aureus, adhesion fibronectin-binding protein A, Kozak sequence, recombinant DNA vaccine,immune response

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31160191, 31260222), Ordinary University Basic Veterinary Medicine Key Disciplines Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region.

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31160191，31260222)，新疆維吾爾自治區(qū)普通高校重點(diǎn)學(xué)科基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)科項(xiàng)目資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)