周傳華，陳曦，馮進(jìn)輝，肖冬光，吳洽慶，朱敦明

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

羥醛縮合反應(yīng)是指含有活性α氫原子的化合物如醛、酮、羧酸和酯等，在催化劑的作用下與羰基化合物發(fā)生親核加成，得到b-羥基醛酮或酸。羥醛縮合反應(yīng)形成新的碳-碳鍵，是有機(jī)合成中極為重要的一類(lèi)反應(yīng)[1]。目前實(shí)現(xiàn)不對(duì)稱(chēng)羥醛縮合反應(yīng)的化學(xué)方法主要有添加手性助劑[2]或用手性路易斯酸[3]、有機(jī)小分子[4-6]等進(jìn)行催化。相對(duì)于化學(xué)催化法，應(yīng)用生物催化劑實(shí)現(xiàn)羥醛縮合反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、綠色無(wú)污染、底物立體選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)上具有良好的應(yīng)用前景。

N-乙酰神經(jīng)氨酸 (Neu5Ac) 是某些復(fù)合糖(糖脂和糖蛋白) 中最常見(jiàn)的碳末端，在抗病毒和抗菌等多方面有生物學(xué)活性，是合成抗病毒試劑扎那米韋 (Zanamivir) 的重要中間體[7]，在生物識(shí)別中有很重要的作用，具有極高的商業(yè)價(jià)值。N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶(N-Acetyl-D-neuraminic acid lyase，EC 4.1.3.3簡(jiǎn)稱(chēng) NAL)是裂合酶(Lyase，EC 4.x.x.x.)的一種，在一定條件下，該酶既可以將 N-乙酰神經(jīng)氨酸 (簡(jiǎn)稱(chēng) Neu5Ac)裂解成 N-乙酰甘露糖胺 (ManNAc)和丙酮酸(Pyr)，又能催化 ManNAc和 Pyr羥醛縮合生成N-乙酰神經(jīng)氨酸[8](圖1)。

NAL在微生物界的分布非常廣泛，多種微生物中都曾檢測(cè)到該酶的活性[9-11]，其中來(lái)源于大腸桿菌 Escherichia coli[12-14]、梭菌屬Clostridium perfringens[15]、嗜血桿菌屬Haemophilus influenza[16]、陰道毛滴蟲(chóng)Trichomonas vaginalis[17]、巴氏桿菌屬Pasteurella multocida[18]和 乳 桿 菌 屬 Lactobacillus plantarum[19]的 N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因已經(jīng)得到克隆和表達(dá)。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)Neu5Ac的制備，是通過(guò)乳酸氧化酶全細(xì)胞催化將乳酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，再用NAL全細(xì)胞催化得到Neu5Ac[20]。在生物催化合成Neu5Ac的反應(yīng)中，最為關(guān)鍵的是醛縮酶 (或裂解酶)的活性。為了獲得更高活性、更有利于合成反應(yīng)的 N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶，可以更高效地合成 Neu5Ac，我們通過(guò)基因挖礦選擇了幾個(gè)不同來(lái)源的基因作為研究對(duì)象，經(jīng)過(guò)初步的研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于葡萄球菌 Staphylococcus hominis的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的活性較高，對(duì)該酶的性質(zhì)進(jìn)行了較詳細(xì)的研究。

圖1 酶法合成Neu5Ac的圖示[8]Fig. 1 Enzymatic synthesis of N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac)from N-acetyl-D-mannosamine (ManNAc)and pyruvate (Pyr)catalyzed by N-acetylneuraminate lyase (NAL)[8].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株 E. coli Trans 5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，pET28a(+)載體和 E. coli BL21 (DE3)均購(gòu)自Novagen公司。

1.1.2 目的基因

通過(guò)基因挖礦獲得候選基因，序列信息來(lái)源于 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (GenBank Accession No.EFS20452.1)，全基因序列由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成。

1.1.3 主要試劑

BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司(CWBIO)；用于蛋白電泳的試劑及N-乙酰神經(jīng)氨酸和乳酸脫氫酶 (LDH)購(gòu)自Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)R250購(gòu)自索萊寶公司 (Solarbio)；限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ以及T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.2 序列分析

氨基酸序列的分析通過(guò) BioEdit軟件(CLUSTAL-W)完成，對(duì)蛋白的理化性質(zhì)初步預(yù)測(cè)通過(guò)網(wǎng)站進(jìn)行 (http://us.expasy.org/admin/users/login)。

1.3 工程菌的構(gòu)建

質(zhì)粒的提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、凝膠電泳、基因的誘導(dǎo)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)操作均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[21]進(jìn)行。DNA膠回收按照膠回收試劑盒 (Tiangen公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。目的基因shnal構(gòu)建至pET-28a質(zhì)粒的NdeⅠ和XhoⅠ兩酶切位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 (DE3)宿主菌中。

1.4 目的蛋白的表達(dá)及純化

將工程菌接入800 mL LB培養(yǎng)基 (含終濃度50 mg/L的卡那霉素)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8左右，添加終濃度為1 mmol/L的異丙基 β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)4～6 h。菌液6 000 r/min離心10 min，生理鹽水洗滌菌體2次，?20 ℃保存。

將細(xì)胞重懸到 100 mL含 5%甘油，500 mmol/L NaCl的 Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L，pH 8.0) 中，通過(guò)高壓勻漿破碎，12 000 r/min、4 ℃離心30 min，除去細(xì)胞碎片。上清用 0.45 μm 的濾膜過(guò)濾后通過(guò)蛋白純化儀(Purifier 10，GE公司)在室溫下用鎳柱純化 (填料購(gòu)自GE Health Care)，3 mL/min流速上樣，用含50 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液 (20 mmol/L，pH 8.0)洗脫雜蛋白，含0～250 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液 (20 mmol/L，pH 8.0)線(xiàn)性洗脫目的蛋白。收集合并目的蛋白，經(jīng)脫鹽濃縮后，適當(dāng)分裝，?80 ℃保存。BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，牛血清白蛋白BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

ShNAL在溶液中的聚集狀態(tài)通過(guò)凝膠層析以及 SDS-PAGE來(lái)進(jìn)行確定。所用層析柱為Superdex 200 10/300 GL，Gel filtration calibration kit (GE)用于標(biāo)準(zhǔn)分子量測(cè)定。流動(dòng)相為含150 mmol/L NaCl的 20 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)，流速為 0.4 mL/min。蛋白的分子量大小通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的保留體積標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較和計(jì)算得到。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為：Ovalbumin(43.0 kDa)，Conalbumin (75.0 kDa)，Conalbumin(158.0 kDa)，F(xiàn)erritin (440.0 kDa)，Thyroglobulin(669.0 kDa)。

1.5 活性的測(cè)定

1.5.1 裂解方向

裂解方向的活性通過(guò)酶標(biāo)儀 (Spectra Max M2/M2e，Molecular Devices公司)測(cè)定，其原理是：N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解生成的丙酮酸能在NADH和乳酸脫氫酶存在的條件下被還原成乳酸，過(guò)程中消耗了NADH，引起340 nm波長(zhǎng)下對(duì) NADH的吸光度的下降[22-23]。一個(gè)酶活力單位定義為：在 pH 7.0、37 ℃下，1 min 裂解 1 μmol的 Neu5Ac生成 1 μmol的 N-乙酰-D-甘露糖胺和丙酮酸所需酶的量。反應(yīng)體系包括 10 mmol/L Neu5Ac、0.25 mmol/L NADH、1 U/mL LDH、0.85 μg ShNAL，反應(yīng)在常溫下不同 pH 的100 mmol/L的緩沖液中進(jìn)行。

1.5.2 合成方向

合成方向的活性通過(guò) HPLC測(cè)定，其原理為：僅加入ManNAc、Pyr和酶，通過(guò)HPLC檢測(cè)Neu5Ac的生成量確定活力大小。一個(gè)酶活力單位定義為：在pH 7.0、37 ℃下，1 min合成的1 μmol Neu5Ac所需要的酶量。反應(yīng)體系包括30 mmol/L ManNAc，100 mmol/L Pyr和 10 μg 的酶，在100 mmol/L的緩沖液中進(jìn)行30 min，添加10 μL濃H2SO4終止反應(yīng)。

1.6 酶的性質(zhì)分析

合成和裂解方向的最適反應(yīng) pH測(cè)定是在100 mmol/L的不同pH值的緩沖液中進(jìn)行的，緩沖體系選用醋酸-醋酸鈉緩沖液 (pH 4.0～6.0)，磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0～8.0)，Tris-HCl緩沖液(pH 8.0～9.0)，碳酸鹽緩沖液 (pH 9.0～11.0)，裂解方向的反應(yīng)溫度為室溫，合成方向的反應(yīng)溫度控制在37 ℃、pH 7.5。合成方向的最適反應(yīng)溫度的測(cè)定是將反應(yīng)放入20 ～65 ℃℃的環(huán)境中進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物生成量，反應(yīng)體系同上所述。

1.7 酶的穩(wěn)定性研究和動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

溫度耐受性測(cè)定是將酶稀釋到 pH 7.0的100 mmol/L的緩沖液中，4 ～60 ℃℃溫浴0.5～2 h，檢測(cè)裂解方向的殘留活性。pH耐受性測(cè)定是將酶稀釋到 pH 4.0～11.0的緩沖液中，4 ℃孵育24 h，測(cè)定裂解方向的殘留活性。

在對(duì)Neu5Ac的動(dòng)力學(xué)測(cè)定中，測(cè)定了不同Neu5Ac濃度下的活性，反應(yīng)在pH 8.0的緩沖液中進(jìn)行。在合成方向，反應(yīng)在pH 7.5的緩沖液中進(jìn)行，測(cè)定ShNAL對(duì)丙酮酸的Km值時(shí)，保持N-乙酰甘露糖胺的濃度為30 mmol/L，測(cè)定不同Pyr濃度下酶的活力；測(cè)定 N-乙酰甘露糖胺的Km值時(shí)，丙酮酸的濃度 (50 mmol/L)不變，測(cè)定N-乙酰甘露糖胺不同濃度下的酶活。

1.8 HPLC分析條件

Agilent公司1100型；分離柱：BioRad公司生產(chǎn)的型號(hào)為 Aminex HPX-87H糖分析柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)，流動(dòng)相：5 mmol/L H2SO4，流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃。在上述條件下檢測(cè)，Neu5Ac、Pyr和ManNAc的保留時(shí)間分別是11.9 min、14.2 min和16.2 min。

1.9 合成產(chǎn)物的分離和鑒定

20 mL的Tris-HCl (100 mmol/L，pH 8.0)緩沖液反應(yīng)體系中加入 300 mmol/L Pyr、100 mmol/L ManNAc、4.5 g濕菌體，在37 ℃、200 r/min條件下反應(yīng)20 h，通過(guò)離心除去菌體，100 ℃加熱除去蛋白終止反應(yīng)。反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率通過(guò)HPLC檢測(cè)ManNAc的減少量得出，產(chǎn)物是通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂 (201×7)分離方法[20]純化。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸序列分析

將來(lái)源于 Staphylococcus hominis與其他菌屬來(lái)源的 N-乙酰胺神經(jīng)氨酸裂合酶氨基酸序列進(jìn)行比較 (圖2)，發(fā)現(xiàn)ShNAL與已知的N-乙酰胺神經(jīng)氨酸裂合酶，與來(lái)源于 Haemophilus influenza[16]、 Clostridium perfringens[15]、Trichomonas vaginalis[17]和 Lactobacillus plantarum[19](GenBank Accession No.分別是P44539.1， Q9S4K9.2， AAB42182.1 和NP_786769.1)的同源性分別為 58%、56%、53%和 50%，而與來(lái)源于 Escherichia coli[11](Accession No. AAC76257.1)的同源性只有30%。

圖2 ShNAL與已知的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶序列的比對(duì)結(jié)果Fig. 2 Multiple sequence alignment for ShNAL and related N-acetylneuraminate lyases.

ShNAL擁有NAL亞家族活性位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基 (圖2)，包括K165、Y137 (僅指ShNAL的氨基酸位點(diǎn)編號(hào)，下同)位點(diǎn)、保守的 GxxGE底物專(zhuān)一性結(jié)合框架 (第 47～51個(gè)氨基酸)以及D191、E192和 S208[24-25]。GxxGE 是 α-酮酸的羧基結(jié)合位點(diǎn)，xx通常是S/T，而ShNAL中這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn) (48、49位)是 S/S，這兩個(gè)連續(xù)的氨基酸與Y137和水分子共同參與形成丙酮酸氫鍵網(wǎng)絡(luò)，D191、E192和S208是底物糖的結(jié)合位點(diǎn)。保守區(qū)域外的位點(diǎn)有較大差異。

2.2 重組酶的純化

通過(guò)鎳柱親和層析一步純化得到電泳純的目的蛋白酶 (圖3和表1)。純化總收率為88.5%，純度提高了5.6倍。在pH 7.0、37 ℃的條件下，裂解方向的比活達(dá)到了 24.8 U/mg (表 1)，在pH 7.5、37 ℃的條件下，合成反應(yīng)方向的比活是3.1 U/mg。用膠過(guò)濾層析測(cè)定ShNAL的確定分子量為125 kDa，其單體分子量為33.8 kDa，因此該酶在溶液中以四聚體形式存在。

2.3 酶的最適反應(yīng)pH和溫度

裂解方向的最適反應(yīng)pH是8.0，高于pH 8.0時(shí)酶的活性迅速下降，當(dāng)pH升至9.0時(shí)活性下降到最高時(shí)的17.5% (圖4)。合成方向的最適反應(yīng)pH是7.5，升高pH對(duì)酶的活性影響不大，在pH 9.0的碳酸鹽緩沖液中該酶仍然能保持最高活力的95%以上 (圖5)。通過(guò)對(duì)ShNAL合成方向的最適反應(yīng)溫度研究發(fā)現(xiàn)，在20 ℃～45 ℃之間，隨溫度升高酶的活力不斷提高，45 ℃時(shí)達(dá)到最大活力，當(dāng)溫度超過(guò) 50 ℃時(shí)酶活迅速下降(圖 6)。溫度對(duì)裂解方向酶活性影響的研究表明(數(shù)據(jù)未顯示)，直到65 ℃時(shí)，酶的活力都隨溫度升高而不斷提高。

圖3 SDS-PAGE分析ShNAL的純化Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified ShNAL. 1:protein marker; 2:cell-free extract without induction 3:crude cell-free extract; 4: purified ShNAL.

表1 ShNAL蛋白純化表Table 1 Purification of ShNAL

圖4 pH對(duì)裂解方向酶活性的影響Fig. 4 Effect of pH on ShNAL activity for the cleavage direction. Acetic acid buffer (pH 4.0 to 6.0), phosphate buffer (pH 6.0 to 8.0)and Tris-HCl buffer (pH 8.0 to 9.0)were used.

圖5 pH對(duì)合成方向酶活性的影響Fig. 5 Effect of pH on ShNAL activity for the synthetic direction. Acetate buffer (pH 4.0 to 6.0), phosphate buffer (pH 6.0 to 8.0), Tris-HCl buffer (pH 8.0 to 9.0)and carbonate buffer (9.0 to 10.0)were used.

2.4 酶的穩(wěn)定性

通過(guò)測(cè)定裂解反應(yīng)活性變化來(lái)研究 ShNAL對(duì)pH的耐受性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ShNAL可以耐受較寬的pH范圍，在中性pH值范圍內(nèi)最穩(wěn)定，在pH 5.0～10.0范圍內(nèi) ShNAL的殘留活性能保持70%以上，但pH 4.0的過(guò)酸環(huán)境和pH 11.0的過(guò)堿環(huán)境都能使酶失活 (圖7)。

圖6 溫度對(duì)合成反應(yīng)酶活性的影響Fig. 6 Effect of temperature on ShNAL activity for synthetic reaction.

圖7 pH的耐受性測(cè)定Fig. 7 pH stability of ShNAL. Acetate buffer (pH 5.0 to 6.0), phosphate buffer (pH 6.0 to 8.0), Tris-HCl buffer(pH 8.0 to 9.0)and carbonate buffer (pH9.0 to 11.0)were used.

通過(guò)測(cè)定裂解方向活性損失對(duì)ShNAL的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)ShNAL具有較好的熱穩(wěn)定性，在4 ℃～45 ℃溫度水浴0.5～2 h均無(wú)活性損失。在30 ℃下孵育210 h，ShNAL的活性沒(méi)有下降，說(shuō)明酶在30 ℃的穩(wěn)定性良好，而當(dāng)溫度升到50 ℃時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)活性不斷下降，50 ℃溫浴0.5 h活性約損失一半 (圖8)。

2.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

測(cè)定合成和裂解兩個(gè)方向的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，裂解方向的Neu5Ac的Km值為 (4.0±0.2)mmol/L，合成方向的 ManNAc和 Pyr的 Km值分別為(131.7±12.1)mmol/L 和 (35.1±3.2)mmol/L。Neu5Ac、Pyr和 ManNAc的 kcat/Km值分別為1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s)和 0.08 (L/mmol·s)。Neu5Ac、Pyr的Km值與目前報(bào)道的來(lái)源于其他菌屬的 N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶相差不大，ManNAc的 Km值比其他來(lái)源的酶都要小。ShNAL與之前研究的動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)比較見(jiàn)表2，ShNAL的裂解方向的催化效率kcat/Km比已知的相關(guān)酶要低，而合成方向的催化效率kcat/Km與它們相當(dāng)，可能更有利于合成反應(yīng)進(jìn)行。

2.6 合成產(chǎn)物的分離和鑒定

圖8 溫度耐受性研究Fig. 8 Thermal stability of ShNAL. Enzyme was incubated at certain temperature and maintain for three different times. Activity of enzyme stored in 4 °C was set as 100% relative activity.

表2 ShNAL與之前報(bào)道的不同來(lái)源的酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較[18-19]Table 2 Kinetic parameters of recombinant ShNAL and other previously described

圖9 Neu5Ac的HPLC圖譜 (A：NeuAc標(biāo)準(zhǔn)樣品；B：ShNAL催化的反應(yīng)；C：NeuAc標(biāo)樣和反應(yīng)物的混合物)Fig. 9 HPLC fingerprint spectrum of Neu5Ac. (A) NeuAc standard sample. (B)Reaction system. (C)Mixture of Neu5Ac standard sample and the reactant.

通過(guò) HPLC檢測(cè)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為 91.5%，Neu5Ac的產(chǎn)率達(dá)到了89.4% (圖9)。反應(yīng)液經(jīng)處理上樣0～0.2 mol/L甲酸洗脫的樣品通過(guò)減壓蒸餾除去甲酸和水，得到了純度較高的產(chǎn)物。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果：MS (ES?)計(jì)算值 C11H19NO9(M-H)308.10，實(shí)驗(yàn)值307.82。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有利用分離純化的 N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶合成Neu5Ac的工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道，限制Neu5Ac工業(yè)化生產(chǎn)的因素很多，如生產(chǎn)原料 ManNAc非常昂貴外，醛縮酶 (或裂解酶)的活性低等也是重要的原因。有效的解決途徑可能是通過(guò)異構(gòu)酶將相對(duì)廉價(jià)的 N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)化成 ManNAc，再在高活性的 N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶催化下來(lái)合成Neu5Ac。

本研究克隆并表達(dá)了來(lái)自 Staphylococcus hominis的潛在 N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因shnal，研究了純化酶的酶學(xué)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，與其他來(lái)源的NAL相比，ShNAL對(duì)ManNAc的Km值最小，kcat/Km值為 0.08 L/(mmol·s)，優(yōu)于之前研究過(guò)的0.05 L/(mmol·s)的最大值；在pH 9.0的環(huán)境中，ShNAL在合成方向仍能保持合成反應(yīng)最適pH下活力的95%，而裂解方向的活性降至最適pH下活力的17.5%，偏堿性條件更利于產(chǎn)物合成。綜合以上特點(diǎn)，ShNAL在合成反應(yīng)中具有一定的優(yōu)勢(shì)，但是酶的催化活性有待進(jìn)一步提高，以滿(mǎn)足工業(yè)化應(yīng)用的要求。

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