于波，曾艷，姜旭，王麗敏，馬延和

1 中國科學院微生物研究所，北京 1001012 中國科學院生命科學與生物技術局工業(yè)生物技術與產(chǎn)業(yè)化處，北京 100864

聚合級L-乳酸的非糧生物質發(fā)酵研究進展

于波1，曾艷2，姜旭1，王麗敏1，馬延和1

1 中國科學院微生物研究所，北京 100101
2 中國科學院生命科學與生物技術局工業(yè)生物技術與產(chǎn)業(yè)化處，北京 100864

于波, 曾艷, 姜旭, 等. 聚合級L-乳酸的非糧生物質發(fā)酵研究進展. 生物工程學報, 2013, 29(4): 411?421.

乳酸在化工、醫(yī)藥和食品加工等領域有著廣泛的用途。隨著聚乳酸產(chǎn)業(yè)的興起，對聚合級 L-乳酸的需求量也不斷增加。開發(fā)低成本的非糧生物質乳酸發(fā)酵工藝、實現(xiàn)發(fā)酵-分離耦合是降低聚合級L-乳酸成本、擺脫原料價格不斷上漲壓力的技術趨勢。文中簡要綜述了近2～3年使用非糧生物質發(fā)酵生產(chǎn)聚合級L-乳酸的技術進展，并對未來乳酸發(fā)酵工藝作了展望。

L-乳酸，非糧生物質，發(fā)酵-分離耦合

乳酸是世界三大有機酸之一，其分子具有一個羥基和一個羧基，可用于合成各種化學品。因此，在化工、醫(yī)藥和食品加工等領域有著廣泛的用途 (圖1)。乳酸具有旋光性，可分為L-乳酸和D-乳酸兩種光學異構體。其中L-乳酸在工業(yè)上用途廣泛，可以脫水生成丙烯酸，酯化生成包括乳酸乙酯在內的各種工業(yè)溶劑，還原生成1,2-丙二醇等各種化工原料。L-乳酸最重要、最大宗的工業(yè)應用是用于生產(chǎn)可降解聚合物-聚乳酸[1]。隨著我們環(huán)境保護意識的不斷增強，大力開發(fā)可生物降解新材料，成為目前世界材料技術發(fā)展趨勢之一。聚乳酸是生物材料中最大的品種，其生產(chǎn)過程無污染，產(chǎn)品可完全生物降解，實現(xiàn)在自然界中的循環(huán)，是理想的綠色高分子材料。目前，全世界塑料產(chǎn)品的年總消費量已超過3億t，我國為3 500萬t以上，如果10～20年后替代石油基聚合物的消費量按10%計，世界聚乳酸需求量每年將達3 000萬t以上，具有廣闊的發(fā)展前景。聚乳酸已被世界視為繼金屬材料、無機材料、化石基高分子材料之后的“第四類最具廣泛應用價值和環(huán)保應用價值的新型高分子材料”，在我國已被持續(xù)列入“十五”、《食品工業(yè)“十一五”綱要》、《國家中長期科技發(fā)展計劃》和《生物基材料產(chǎn)業(yè)科技發(fā)展“十二五”專項規(guī)劃》重點科研攻關項目之一。

作為生產(chǎn)聚乳酸材料關鍵的單體，聚合級L-乳酸的需求量也在不斷攀升。近幾年，乳酸在食品和醫(yī)藥等領域的應用比例基本持平甚至有所下降，而在聚合材料的應用比例快速增長，預計2013年的需求比例將超過40%，因此，未來工業(yè)對乳酸的需求增長點將從食品級 L-乳酸逐步過渡到聚合級L-乳酸[2]。作為大宗的生物基材料，目前聚乳酸的價格偏高，還無法與石化來源的材料相競爭。乳酸的價格將是決定聚乳酸產(chǎn)業(yè)未來是否能與化學基材料相抗衡的關鍵[3]。同時，作為未來優(yōu)先發(fā)展的 30種生物質來源的重要平臺化學品之一 (美國能源部報告-《Top Value Added Chemicals from Biomass》，2004 年 8 月)，乳酸的生產(chǎn)成本也將是決定乳酸在其他工業(yè)領域應用的重要因素。目前，隨著來源于食物作物的淀粉糖的價格不斷攀升，乳酸發(fā)酵工業(yè)的利潤逐漸降低。因此，開發(fā)其低成本發(fā)酵工藝，尤其是采用各種廉價非糧生物質原料來進行發(fā)酵生產(chǎn)將是降低乳酸生產(chǎn)成本，促進聚乳酸產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要技術趨勢。

圖1 乳酸平臺化學品及其衍生品Fig. 1 Platform chemicals of lactic acid and its derivatives.

乳酸發(fā)酵采用的菌種主要有米根霉Rhizopus oryzae和一些細菌等。米根霉生產(chǎn)L-乳酸的光學純度較高，因而受到一定的關注[4-5]。然而，米根霉發(fā)酵產(chǎn)酸的轉化率較低，經(jīng)濟性不夠[6]。目前產(chǎn)業(yè)上發(fā)酵菌種還是細菌類為主，包括乳桿菌和芽胞桿菌等。本文將重點關注近2～3年國際上乳酸發(fā)酵研發(fā)的最新報告，著重介紹采用廉價的非糧原料，如纖維素原料、木薯、菊芋、花生粕等為發(fā)酵基質生產(chǎn)高光學純 L-乳酸的工藝和乳酸清潔發(fā)酵工藝進展，并對未來乳酸發(fā)酵工藝作了展望。

1 廉價非糧原料發(fā)酵L-乳酸

從經(jīng)濟的角度看，發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸依賴多方面的因素，而原材料的支出顯得尤為重要。用糖類 (葡萄糖、蔗糖、淀粉等) 作為底物生產(chǎn)乳酸成本較高。目前，利用廉價原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究主要集中在纖維素、木薯、糖蜜、菊芋等。

1.1 纖維素原料

木質纖維素以其大量，可持續(xù)和廉價的優(yōu)勢成為一種有前景的底物原料。利用纖維素為原料生產(chǎn)乳酸也受到很多的關注。已經(jīng)有很多綜述文章討論了乳酸菌以木質纖維素為原料生產(chǎn)乳酸的常規(guī)過程，包括：原料預處理，酶解得到發(fā)酵用糖，發(fā)酵技術和乳酸的分離純化[7]。本文將簡單綜述一下 2010年以來利用纖維素生物質發(fā)酵乳酸的最新進展情況 (表1)。

凝結芽胞桿菌是近年來報道比較多的，可以利用纖維素資源發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的菌株。最早報道的高產(chǎn)乳酸的凝結芽胞桿菌Bacilluscoagulans36D1是由美國佛羅里達大學分離獲得的一個嗜熱乳酸發(fā)酵菌，它能夠通過磷酸戊糖途徑有效利用戊糖，能利用木質纖維素中的糖分。在50 ℃和pH 5.0的條件下，可同步糖化發(fā)酵纖維素，能從木糖和葡萄糖中得到高濃度 (150～180 g/L)的乳酸，并且副產(chǎn)物少。在近期的文章報道中，Bacilluscoagulans36D1可以同步糖化發(fā)酵結晶纖維素，L-乳酸的發(fā)酵濃度達80 g/L，轉化率接近80%，顯示了該菌在纖維素利用方面的優(yōu)勢[8]。

表1 利用纖維生物質資源生產(chǎn)L-乳酸Table 1 Lactic acid production from cellulosic biomass

我國科研工作者報道了一株高效生產(chǎn) L-乳酸的嗜熱芽胞菌BacilluscoagulansNL01。采用非滅菌的開放式發(fā)酵工藝條件，以NaOH作為堿性中和劑調酸。分批發(fā)酵中，用酶法糖化的含有固體殘留物的木質纖維素水解液生產(chǎn)出56.37 g/L的L-乳酸。補料分批發(fā)酵中，利用木質纖維素水解液的L-乳酸發(fā)酵水平達到75.03 g/L，轉化率為74.5%，平均產(chǎn)率為1.04 g/(L?h)[9]。利用該菌株在非滅菌條件下發(fā)酵木糖生產(chǎn)乳酸。經(jīng)過72 h的分批發(fā)酵，從100 g/L的木糖中得到了75 g/L的乳酸。通過實驗還發(fā)現(xiàn)，乙酸和乙酰丙酸被認定為木糖發(fā)酵中重要的抑制劑，它們顯著地降低乳酸生產(chǎn)率。但是低濃度的甲酸 (＜2 g/L)對乳酸生產(chǎn)表現(xiàn)出促進作用[10]。Wang等報道了利用一株嗜熱菌BacilluscoagulansXZL9發(fā)酵玉米芯糖蜜，該菌株可以同等利用五碳糖和六碳糖，L-乳酸的發(fā)酵濃度達到74.7 g/L[14]。Xue等報道了嗜熱菌BacilluscoagulansXZL4利用玉米秸稈水解液為碳源和花生粕為廉價氮源發(fā)酵生產(chǎn) L-乳酸。在分批發(fā)酵中，乳酸發(fā)酵濃度達到81.0 g/L，糖酸轉化率達到98%，光學純度大于99.9% (發(fā)酵液中檢測不到D-乳酸)，發(fā)酵水平和轉化率均為目前文獻報道的最高值[13]。

除凝結芽胞桿菌外，近期也報道了一些其他種屬的菌株具有高效利用纖維素發(fā)酵產(chǎn)乳酸的例子。Zhao等分離到一株對溫度和木質纖維素具有高度耐受性的乳酸生產(chǎn)菌株乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiDQ2。該菌能夠在玉米秸稈的高固體負荷的條件下同步糖化發(fā)酵產(chǎn)高濃度的乳酸。玉米秸稈先用硫酸進行預處理，然后通過生物解毒去除預處理過程中產(chǎn)生的抑制劑。在48 ℃，pH 5.5，近30% (W/W) 的固體負荷條件下，L-乳酸的濃度最大可以達到101.9 g/L，轉化率為 77.2%，產(chǎn)率為 1.06 g/(L?h)[15]。Abdel-Rahman等報道了一株能夠高效利用葡萄糖和纖維二糖產(chǎn)L-乳酸的菌株腸球菌Enterococcus mundtiiQU25。該菌株能夠同時代謝葡萄糖和纖維二糖，且沒有明顯的碳代謝產(chǎn)物抑制。在最適培養(yǎng)條件下，其高光學純度的L-乳酸產(chǎn)量隨著纖維二糖濃度的增加而增加，這表明Enterococcus mundtiiQU25在以纖維素水解液為原料高效生產(chǎn)乳酸方面有巨大潛力[16]。該菌株還能夠有效利用木糖生產(chǎn)L-乳酸。在分批發(fā)酵中，L-乳酸的發(fā)酵濃度達到87 g/L，轉化率為0.84 g/g，并且具有極高的光學純度 (≥99.9%)[17]。Cui等采用混合培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus和短乳桿菌Lactobacillus brevis來提高纖維素和半纖維素衍生糖 (來源于玉米秸稈) 的利用率從而提高乳酸的產(chǎn)量。在利用堿處理后的玉米秸稈的同步糖化發(fā)酵過程中，混合培養(yǎng)發(fā)酵菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸獲得了0.70 g/g的轉化率，這比單獨培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌和短乳桿菌的轉化率分別高出了18.6%和29.6%[19]。

工程項目質量，由于其影響因素多，波動大、變異大、隱蔽性以及終檢局限大等特點，造成工程項目質量管理中往往會不可避免地出現(xiàn)一些問題，工程項目質量管理不是一個單一的短期的過程，而應該是一個長期的系統(tǒng)的過程。施工項目質量控制的系統(tǒng)過程主要分為事前質量控制，事中質量控制和事后質量控制。

Saito等也進行了米根霉的篩選，其希望獲得能高效利用纖維素資源生產(chǎn)乳酸的優(yōu)良米根霉菌株。他們從 56株米根霉中篩選到一株最優(yōu)菌Rhizopus oryzaeNBRC 5378，該菌株能夠利用木糖生產(chǎn)乳酸。通過同步糖化發(fā)酵小麥秸稈中的纖維素和半纖維素，但糖酸轉化率僅為0.23 g/g[18]。

凝結芽胞桿菌具有嗜熱性，可以進行不用滅菌的開放式發(fā)酵以顯著降低生產(chǎn)成本[20]。同時凝結芽胞桿菌產(chǎn)乳酸的糖酸轉化率 (＞95%)，生產(chǎn)的 L-乳酸光學純度高 (＞99%)，與報道的其他菌株相比較，L-乳酸的發(fā)酵水平也較高，因此凝結芽胞桿菌更適應于纖維素為底物的高光學純L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)。但總體上說，在現(xiàn)有的技術水平下，木質纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵水平距離工業(yè)化還有一定的距離，生產(chǎn)強度也較低，經(jīng)濟性不足。需要進一步的技術研發(fā)，就乳酸發(fā)酵過程而言，最主要的技術突破是要加強菌株本身對纖維素水解液中抑制發(fā)酵成本，如糠醛類化合物的耐受性，從而顯著提高發(fā)酵強度和發(fā)酵水平。

1.2 木薯

木薯(Cassava)是世界三大薯類之一，廣泛栽培于熱帶和亞熱帶地區(qū)。在我國南亞熱帶地區(qū)，木薯是僅次于水稻、甘薯、甘蔗和玉米的第五大作物。它在飼料生產(chǎn)、工業(yè)應用等方面具有重要作用，已成為廣泛種植的淀粉加工和飼料作物。目前，有少量文章報道利用木薯粉作為唯一碳源發(fā)酵生產(chǎn) L-乳酸的工藝。John等報道了利用木薯渣生產(chǎn)L-乳酸的工藝，采用同步液化糖化發(fā)酵工藝，乳酸的發(fā)酵水平達到 83.8 g/L, 轉化率為0.96 g/g[21]。我國科研工作者報道了一株鼠李糖乳桿菌發(fā)酵木薯粉產(chǎn)乳酸，在同步糖化發(fā)酵工藝條件下，乳酸的發(fā)酵水平超過 175 g/L，轉化率0.71 g/g，發(fā)酵強度1.8 g/(L?h)，這是目前報道的利用木薯粉一步發(fā)酵法生產(chǎn) L-乳酸的最高水平[22]。Phrueksawan等報道了一株米根霉具有利用木薯漿固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的能力，在最適條件下，米根霉轉化木薯漿成乳酸鹽的轉化率為0.21 g/g。經(jīng)過加入纖維素酶和糖化酶處理，釋放更多的碳源后，乳酸鹽對木薯漿的轉化率提高到0.46 g/g[23]。

利用木薯粉為廉價原料發(fā)酵乳酸的產(chǎn)業(yè)化推進已經(jīng)走到了前面。全球最大的乳酸生產(chǎn)商PURAC公司已經(jīng)在泰國建立了基于木薯為原料的L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)線 (www.purac.com)，這也彰顯了木薯在乳酸和其他大宗化學品發(fā)酵生產(chǎn)中的廣闊應用前景。

1.3 菊芋

菊芋Jerusalem artichoke，俗名洋姜，菊科，向日葵屬，多年生草本植物。菊芋原產(chǎn)北美洲，經(jīng)歐洲傳入我國。其土壤適應性強、無病蟲害，可以在干旱、鹽堿等非耕邊際土地種植，是一種典型的非糧生物質資源。現(xiàn)有文獻報道多集中在利用菊芋發(fā)酵產(chǎn)乙醇或2,3-丁二醇等[24-25]。利用菊芋或菊芋工業(yè)廢渣為原料生產(chǎn)乳酸，也將是降低乳酸發(fā)酵成本的重要途徑之一。

我國浙江大學的研究者在纖維床生物反應器 (Fibrous bed bioreactor) 中利用固定化的乳酸乳球菌Lactococcus lactis細胞發(fā)酵菊芋水解液生產(chǎn)L-乳酸。首先在95 ℃條件下，酸處理后得到菊芋水解液。進而利用水解液添加酵母粉為氮源發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。在該條件下，固定化細胞比游離細胞都表現(xiàn)出更優(yōu)異的L-乳酸生產(chǎn)能力。分批補料模式下，最大L-乳酸濃度達142 g/L，隨后的纖維素生物反應系統(tǒng)反復分批發(fā)酵進一步表現(xiàn)出該系統(tǒng)長期高產(chǎn)L-乳酸的持續(xù)性和穩(wěn)定性。結果表明，纖維床生物反應器系統(tǒng)和菊芋水解液在工業(yè)規(guī)模下經(jīng)濟生產(chǎn) L-乳酸具有潛力[26]。中國科學院微生物研究所也開發(fā)了菊芋粉發(fā)酵生產(chǎn)高光學純L-乳酸的工藝。利用酶解工藝后的菊芋水解液和廉價的玉米漿粉為發(fā)酵基質，采用高溫發(fā)酵工藝，L-乳酸的發(fā)酵水平達到 134 g/L，轉化率達到了0.96 g/g總還原糖，光學純度也達到了99%以上。該工藝采用常規(guī)發(fā)酵工藝，更有利于直接用于現(xiàn)有乳酸工業(yè)生產(chǎn)線，具有較好的應用前景[27]。

1.4 其他廉價非糧原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸

除了應用纖維素生物質資源、木薯粉及菊芋粉等目前研究比較多的廉價非糧原料發(fā)酵乳酸外，近期部分文獻也介紹利用其他工業(yè)廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。

1.4.1 其他廉價碳源發(fā)酵

從稻米洗滌排水池中分離得到一株產(chǎn)乳酸菌Lactobacillus rhamnosusM-23，它能夠利用未經(jīng)滅菌的稻米洗滌污水和米糠同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，且無需添加其他營養(yǎng)物質。其最大乳酸產(chǎn)量達59 g/L，產(chǎn)率為1.23 g/(L?h)，產(chǎn)品光學純度達95%，轉化率達到了0.85 g/g[28]。Secchi等報道了利用生產(chǎn)乳清干酪后的副產(chǎn)品生產(chǎn)L-乳酸。乳清干酪的副產(chǎn)品含有大量的乳糖，因而是一種環(huán)境污染物。為了評估將乳清干酪副產(chǎn)品生物轉化成乳酸是否為一種可行的處理辦法，并且提供額外附加值，Secchi等研究了干酪乳桿菌Lactobacillus casei、瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus和嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus利用乳清干酪副產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的可能性。結果表明，乳清干酪副產(chǎn)品能被用來生產(chǎn)乳酸，且轉化率達92%。進一步通過添加營養(yǎng)劑顯著提高了乳酸菌的發(fā)酵性能，乳酸的產(chǎn)率達2 g/(L?h)。并且與純培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)能夠降低營養(yǎng)補充劑的用量，利用干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合培養(yǎng)，得到了光學純度達99%的L-乳酸[29]。

水網(wǎng)藻Hydrodictyon reticulatum含有47.5%的還原糖，包括35%的葡萄糖。因此，它可被作為生產(chǎn)L-乳酸的乳酸菌的底物。韓國學者分離獲得的一株副干酪乳桿菌Lactobacillus paracaseiLA104，該菌株利用水網(wǎng)藻為發(fā)酵基質，采用同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，其轉化率達46 g乳酸/100 g干水網(wǎng)藻，乳酸終濃度為37 g/L，產(chǎn)率為1.03 g/(L?h)[30]。

1.4.2 廉價氮源發(fā)酵

氮源最主要的功能是構成微生物細胞和含氮的代謝產(chǎn)物。乳酸細菌對營養(yǎng)物質要求較高，酵母粉含有豐富的氨基酸、維生素和微量元素，是目前在乳酸發(fā)酵研究中應用最為廣泛的氮源。但是酵母粉的成本較高，尋找合適的酵母粉替代物是研究的熱點[31]。在乙醇工業(yè)中會產(chǎn)生大量的乙醇發(fā)酵廢液，乙醇發(fā)酵廢液是啤酒酵母發(fā)酵經(jīng)濟作物后的廢棄物，其中含有大量的可溶性蛋白和氨基酸等發(fā)酵原料，具有作為一種替代酵母抽提物的潛力。利用Lactobacillus paracasei為發(fā)酵菌種，通過優(yōu)化發(fā)酵溫度、pH值和乙醇發(fā)酵液的自溶時間，最終乳酸濃度、全部乳酸產(chǎn)量和乳酸轉化率比使用的酵母抽提物發(fā)酵分別提高了17%、41%和 14%[32]。Djuki?-Vukovi?等研究了利用酒糟平行生產(chǎn)乳酸和菌體生物量的可能性。在分批發(fā)酵中，初始糖濃度為55 g/L，其最高乳酸轉化率和產(chǎn)率分別為92.3%和1.49 g/(L?h)。進一步采用分批補料發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量明顯提高。且發(fā)酵液中的Lactobacillus rhamnosusATCC7469活細胞數(shù)達109CFU/mL，可作為一種富含生物量的生物飼料，提高了利用酒糟發(fā)酵乳酸的經(jīng)濟性[33]。最近報道的一株Bacillus subtilisMUR1能分別在12 h和52 h內生產(chǎn)99.3 g/L和183.2 g/L的 L-乳酸，且底物轉化率達 98.5%，其最大的L-乳酸產(chǎn)率為 16.1 g/(L?h)，并且該菌生產(chǎn) L-乳酸的培養(yǎng)基可用玉米漿部分替代酵母抽提物[34]。乳桿菌Lactobacillussp. B2能利用蔗糖漿為碳源，發(fā)酵螃蟹廢棄物為氮源，實現(xiàn)了幾丁質和L-乳酸的聯(lián)產(chǎn)。在生產(chǎn)幾丁質的同時，發(fā)酵獲得了19.5 g/L的乳酸 (轉化率為77%)[35]。

2 乳酸發(fā)酵-膜分離耦合新工藝

傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程中為了降低乳酸對菌株的抑制，普遍采用鈣鹽調酸技術，即添加CaCO3或Ca(OH)2將發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸轉變?yōu)槿樗徕}，進而通過硫酸置換純化技術獲得L-乳酸。鈣鹽法提取工藝流程長、污染大，產(chǎn)生大量的CaSO4殘渣，且產(chǎn)品質量差，難以滿足聚乳酸生產(chǎn)的原料要求。另一方面，發(fā)酵過程中加堿生成的乳酸鹽仍然對細胞代謝有抑制作用，其現(xiàn)象是產(chǎn)物乳酸濃度和細胞產(chǎn)乳酸速度成反比，隨著乳酸鹽濃度的升高，對細胞的生理活性的抑制也在不斷加劇，以致細胞最后停止生長。如果能開發(fā)一個新的工藝，將反應與分離進行耦合，可以原位移走目標產(chǎn)物，有效減少產(chǎn)物的反饋抑制，實現(xiàn)邊發(fā)酵、邊分離，提高發(fā)酵產(chǎn)率?；谝陨显颍l(fā)酵和分離耦合的新型連續(xù)發(fā)酵工藝則成為了國內外研究的熱點[36]。

膜分離技術具有分離效率高、操作條件溫和、分離介質無毒、沒有二次污染、工藝放大可靠等優(yōu)點。Freidman和Gaden于1970年最先報道了發(fā)酵-透析耦合連續(xù)生產(chǎn)乳酸的研究，結果發(fā)現(xiàn)利用葡萄糖為底物，乳酸發(fā)酵產(chǎn)率可在傳統(tǒng)批次式的一般不超過 3.0 g/(L?h)的基礎上提高 60%[37]。早期采用的透析技術因分離效率不高，對乳酸耦合發(fā)酵水平的提高程度有限。上世紀 80年代以來，隨著錯流式膜分離技術的不斷發(fā)展與成熟，針對乳酸發(fā)酵-錯流式膜分離耦合過程的研究日益增多。乳酸發(fā)酵產(chǎn)率得到了大幅提高，最高已能達到22.0 g/(L?h)，顯示了膜分離技術與發(fā)酵耦合生產(chǎn)乳酸的應用前景[38]。近期，Wang等開發(fā)了一種雙極膜分離工藝來探討了乳酸發(fā)酵和電滲析分離相結合的兼容性。將發(fā)酵過的乳酸鹽混合物流經(jīng)雙極膜進行電滲析，并對其影響乳酸產(chǎn)量和堿液的動態(tài)電流密度進行了研究和條件優(yōu)化。最后，進行了乳酸發(fā)酵和雙極膜電滲析分離耦合實驗，并達到了 86%的乳酸回收率[39]。

Bailly等建立了一個完整的全膜乳酸生產(chǎn)工藝，采用兩步電滲析法純化乳酸。發(fā)酵液首先利用微濾膜澄清，去除菌體及大分子蛋白質。由于發(fā)酵液采用的鈣鹽調酸工藝，發(fā)酵液的二價金屬離子，在雙極膜操作過程中易造成膜的污染，所以發(fā)酵液再次經(jīng)過納濾工藝去除二價金屬離子。澄清的發(fā)酵液經(jīng)過第一步電滲析濃縮后，再經(jīng)過雙極膜的二次電滲析轉化為乳酸和相應的堿，堿返回發(fā)酵罐再次作為中和劑使用[40]。雖然Habova等進一步證明此兩步電滲析法生產(chǎn)乳酸的過程環(huán)境友好[41]，但是該工藝需要經(jīng)過多次膜分離，增加了膜污染的步驟，進而增加了膜分離的成本，并且此過程無法實現(xiàn)發(fā)酵分離耦合。如果從乳酸發(fā)酵工藝入手，使用一價離子堿調酸，可以避免二價金屬離子對膜的污染。然而，鈉等一價金屬離子對乳酸發(fā)酵菌株的毒性較大，顯著抑制了乳酸發(fā)酵強度和發(fā)酵水平。因此，開發(fā)新的乳酸發(fā)酵菌種，例如可以使用鈉鹽或銨鹽發(fā)酵的菌株，配合膜分離耦合工藝，可以顯著提高膜分離的經(jīng)濟性。Qin等通過離子束誘變提高了一株芽胞桿菌的鈉鹽耐受能力，誘變后的菌株Bacillussp. Na-2在使用NaOH調酸工藝條件下，L-乳酸發(fā)酵水平超過100 g/L[42]。

3 鈉鹽調酸條件下的L-乳酸發(fā)酵新工藝

利用 NaOH代替 CaCO3作為乳酸發(fā)酵的中和劑，可以解決目前“鈣鹽法”乳酸發(fā)酵傳統(tǒng)工藝對環(huán)境的污染問題。自然界中存在大量的嗜極微生物，能夠耐受類似于工業(yè)加工條件下的各種極端環(huán)境，其中嗜堿微生物由于具有良好的耐受一價金屬離子的能力，或許可以成為乳酸等有機酸發(fā)酵的優(yōu)良宿主，而逐步獲得了科研工作者的重視[43]。嗜堿菌是一類最適生長pH在8.0以上(通常在9.0～10.0之間) 的微生物。很多嗜堿菌同時也是嗜鹽菌[44]。使用嗜堿菌進行乳酸發(fā)酵具有很多的優(yōu)勢。一方面在嗜堿乳酸菌的發(fā)酵過程中，可以利用 NaOH代替 CaCO3作為中和劑來維持發(fā)酵過程中pH的穩(wěn)定，中和形成的乳酸鈉可以使用雙極性膜電滲析法進行乳酸的提取和分離，避免了傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中CaSO4固體廢料的產(chǎn)生，從而降低污染，保護環(huán)境，而提取乳酸后產(chǎn)生的NaOH可以作為中和劑循環(huán)使用，降低成本。另一方面由于中和劑和乳酸的反應，乳酸發(fā)酵液中含有高濃度的鹽離子，而嗜堿乳酸菌相對中性乳酸菌來講具有嗜鹽或者耐鹽的性質，有利于嗜堿微生物的生長，可以在一定程度上提高乳酸發(fā)酵的產(chǎn)量。此外，嗜堿菌對高pH值的適應性還可以避免雜菌污染[43]。

目前，對嗜堿菌株作為乳酸發(fā)酵生產(chǎn)菌的報道較少。日本學者Calabia等首先報道了一株生產(chǎn)乳酸的嗜堿微生物嗜鹽乳桿菌Halolactibacillus halophilus。該菌株可以利用蔗糖和葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)乳酸。其中利用蔗糖為底物，L-乳酸的終濃度為65.8 g/L，糖酸轉化率為83%，光學純度為98.8%；在以葡萄糖為底物時，L-乳酸的終濃度為59.6 g/L，糖酸轉化率為76%，光學純度為98.3%。該菌株的底物耐受性欠佳，當蔗糖或葡萄糖的底物濃度提高到100 g/L時，乳酸的終產(chǎn)量分別下降到28.2 g/L和34.5 g/L[45]。中國科學院微生物所極端微生物研究組新分離獲得了一株嗜堿菌芽孢桿菌Bacillussp. WL-S20，該菌株可以利用葡萄糖和廉價氮源花生粕高效發(fā)酵生產(chǎn) L-乳酸，并且發(fā)酵液中 L-乳酸的光學純接近100% (檢測不到D-乳酸)。經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化后，單次補料分批發(fā)酵，L-乳酸的終濃度達到180 g/L，糖酸轉化率為98.6%。多次脈沖分批補料發(fā)酵，L-乳酸的最高濃度可達 225 g/L，糖酸轉化率為99.3%[46]。嗜堿菌Bacillussp. WL-S20的L-乳酸發(fā)酵能力超過了很多非極端菌的發(fā)酵水平，豐富了 L-乳酸發(fā)酵菌株資源，為開展新型的乳酸發(fā)酵-分離耦合工藝發(fā)酵工藝提供了新思路。

4 未來乳酸發(fā)酵技術展望

乳酸也是一種多用途的綠色平臺化合物。乳酸、乳酸鹽及其衍生物已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工、制革、環(huán)保、釀造及紡織等工業(yè)領域，乳酸及其衍生物的需求量逐年遞增。隨著葡萄糖等原料成本的不斷上漲，乳酸的生產(chǎn)成本也在不斷的增加，已經(jīng)嚴重影響了乳酸發(fā)酵行業(yè)的利潤率。如何在價格不斷上漲的原料成本壓力下實現(xiàn)乳酸的低成本生物制造是擺在乳酸產(chǎn)業(yè)面前的一個非常嚴峻的問題。通過經(jīng)濟-技術性分析，未來的乳酸發(fā)酵工業(yè)可能要實現(xiàn)連續(xù)厭氧發(fā)酵，工業(yè)發(fā)酵水平要超過180 g/L，轉化率超過95%，發(fā)酵強度要達到20 g/(L?h)[47]。目前，現(xiàn)報道的菌株對廉價非糧生物質的利用效率不高，還需要通過進一步的菌株改造，優(yōu)化底物利用速率和效率，以及通過生理工程改造提高菌株的工業(yè)適應性等[48]。隨著技術的不斷進步，我們完全可以實現(xiàn)工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)線上的乳酸發(fā)酵水平超過180 g/L，轉化率超過 95%的指標。但是，乳酸的發(fā)酵是典型的產(chǎn)物抑制型發(fā)酵，高濃度的乳酸(鹽) 會顯著影響菌體的生長和產(chǎn)酸效率。實現(xiàn)20 g/(L?h) 的高強度發(fā)酵對乳酸發(fā)酵菌種生理適應性是一個重大的挑戰(zhàn)，雖然合成生物學的發(fā)展使顯著提高菌株的工業(yè)適應能力成為了可能[49]，但是要達到如此高強度的發(fā)酵速率，單純靠菌株本身的改造是難以實現(xiàn)的，需要結合過程工藝的優(yōu)化。同時，為了提高乳酸發(fā)酵的經(jīng)濟性，開展連續(xù)厭氧發(fā)酵工藝是趨勢，而基于膜分離技術的發(fā)酵-分離耦合工藝，可以實現(xiàn)乳酸的連續(xù)厭氧發(fā)酵和低成本分離。通過開發(fā)適用于鈉鹽調酸工藝的新菌種，結合低污染的動態(tài)旋轉膜分離工藝，實現(xiàn)乳酸發(fā)酵-分離耦合，可以降低對乳酸發(fā)酵菌株的抑制，顯著提高發(fā)酵強度和轉化率，這將是乳酸和其他大宗有機酸實現(xiàn)高強度、低成本發(fā)酵的一個技術方向。

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January 11, 2013; Accepted: January 23, 2013

Bo Yu. Tel: +86-10-62555203; E-mail: yub@im.ac.cn

Trends in polymer-grade L-lactic acid fermentation by non-food biomass

Bo Yu1, Yan Zeng2, Xu Jiang1, Limin Wang1, and Yanhe Ma1
1Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China
2Division of Industrial Bio-Tech Research and Development,Bureau of Life Science and Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100864,China

Lactic acid has a wide range of uses in the chemical, pharmaceutical and food industry. With rapid development of poly (lactic acid) industry, the demand for polymer-grade L-lactic acid is continuously increasing.Developing low-cost, non-food-biomass-lactic-acid fermentation process and the fermentation-separation coupled technology are trends to reduce polymer-grade L-lactic acid production cost. This review summarized the most recent advances in low-cost L-lactic acid fermentation based on the use of non-food biomass, followed by addressing the key issue that might be strategically important for future development of polymer-grade L-lactic acid production in industry.

L-lactic acid, non-food biomass, fermentation-separation coupled technology

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA02A202).

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2011AA02A202) 資助。

時間：2013-03-13 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130313.1519.002.html

(本文責編 陳宏宇)