高 鵬，王 艷，何 江，伍 玲，謝 艷，伏 毅，黃 敏

（四川省原子能研究院，四川成都 610101）

豬肉是目前人們餐桌上重要的動物性食品之一，能提供優(yōu)質蛋白質和必需的脂肪酸。以豬皮和瘦豬肉為原料的水晶肘花是對豬皮進行的深加工產品，潔白晶瑩，味道鮮香，含有豐富的蛋白質，深受人們喜愛[1]。但因肉制品營養(yǎng)豐富，水分活度較高，腐敗菌微生物容易生長和繁殖，加上加工所用的原輔料種類繁多、來源復雜，源頭污染和二次污染難以徹底控制，如只采用傳統的高溫法處理，一部分耐熱微生物仍能殘存，極易導致肉制品發(fā)生微生物性腐敗[2]。一些肉制品在腐敗前會出現白斑現象，這些白斑的形成原因是什么？白斑是否由腐敗微生物引起？是否與產品的腐敗有直接的關系？如何預防白斑的產生？解決這些問題對肉制品生產企業(yè)來說就顯得尤其重要。本文將對水晶肘花長白斑現象進行初步的微生物分析。以往腐敗微生物的檢測大多數是根據菌落形態(tài)及生理生化特征來確定其類型[3]。該方法存在耗時長（一般的腐敗微生物檢測需要2～5d），操作繁瑣，結果不夠準確的缺點[4]。而PCR技術（聚合酶鏈式反應）所具有的特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點，可以彌補該檢測方法的不足。本文將傳統培養(yǎng)和16S rDNA序列分析方法相結合，對正常和長白斑的肘花產品中的微生物通過普通培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)后進行分離、純化，然后進行16S rDNA鑒定，比較產品變質前后微生物種類的變化，推測引起產品長白斑的微生物原因，為企業(yè)在實際生產中解決問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正常以及長白斑的水晶肘花產品 成都市某食品廠提供；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（分離和純化好氧和兼性厭氧菌）和厭氧培養(yǎng)基（分離和純化厭氧和兼性厭氧菌）購于北京奧博星生物科技有限公司；瓊脂糖、EDTA、Goldview、dNTPs、TaqDNA聚合酶 上海生物工程有限公司；TIANamp Bacteria DNA kit、Universal DNA Purification kit 天根生化（北京）有限公司；16S rDNA引物 正向5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’，反向5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’，上海英駿生物技術有限公司。

PCR儀、瓊脂糖電泳系統、凝膠成像儀 美國Bio-rad公司；離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產品中微生物的分離和純化[4]按照國標GB 4789.2-2010[5]的方法分別處理正常和長白斑樣品，并進行梯度稀釋。需氧菌和厭氧菌的培養(yǎng)按以下方法進行。

1.2.1.1 需氧菌培養(yǎng) 將接種了各稀釋度樣品的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于36℃培養(yǎng)48h后，挑取不同形態(tài)（顏色、大小等）的代表性菌落進行分離純化。

1.2.1.2 厭氧菌培養(yǎng) 將接種了各稀釋度樣品的厭氧瓊脂培養(yǎng)基，采用燭缸法和焦性沒食子酸法相結合在密封的干燥器中36℃培養(yǎng)48h。挑取不同形態(tài)（顏色、大小等）的代表性菌落進行分離純化。

1.2.2 形態(tài)特征

1.2.2.1 菌落特征 包括菌落表面形狀、菌落表面（干燥、濕潤）、菌落大小、邊緣形狀、菌落顏色。

1.2.2.2 菌體形態(tài) 包括是否有芽孢、芽孢位置、是否膨大、具體形狀。

1.2.3 16S rDNA特征序列分析

1.2.3.1 微生物的分離和基因組DNA提取 挑取的單菌落進行富集培養(yǎng)，取1.5mL培養(yǎng)液，用TIANamp Bacteria DNA kit（細菌基因組DNA提取試劑盒）提取基因組DNA。

1.2.3.2 細菌16S rDNA序列擴增 用細菌16S rDNA引物進行PCR擴增。50μL反應體系：10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L MgCl24μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 32.75μL，模板DNA 2μL。反應程序：94℃預變性5min，94℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸90s，32個循環(huán)，72℃延伸8min[6]。擴增產物經1%瓊脂糖電泳，Universal DNA Purification kit（DNA純化回收試劑盒）膠回收后，置于-20℃儲藏備用。

1.2.3.3 16S rDNA序列的測定 PCR產物的測序工作由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.2.3.4 序列分析 測序結果提交NCBI GenBank進行BLAST相似序列檢索，使用Clustal X1.83軟件進行比對，再用MEGA 5軟件包構建進化樹。

1.3 生理生化特征

包括淀粉水解，氧化酶實驗，產氣實驗，運動性，M.R和V.P實驗，木糖發(fā)酵，葡萄糖發(fā)酵，硝酸鹽還原、檸檬酸鹽還原，精氨酸雙水解酶，好氧性，生長溫度、pH和耐鹽性等。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化結果

接種了各稀釋度樣品的平板在36℃培養(yǎng)48h后，綜合營養(yǎng)瓊脂和厭氧兩種培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)（大小、顏色），挑取有代表性菌落進行分離純化，對照組和白斑組分別得到14個純化后的菌株。圖1為在36℃培養(yǎng)48h后部分營養(yǎng)瓊脂平板的菌落情況。

圖1 部分平板在36℃培養(yǎng)48h后的菌落情況（稀釋度為10-1）Fig.1 Partofcoloniesinplatesafter48hat36℃（Diluted10times）

2.2 菌落特征

分離純化后細菌的菌落特征見表1。

根據表1中的菌落形態(tài)和菌體特征結果，可以判斷對照組中分離到的細菌主要為革蘭氏陰性桿菌，而白斑組中除了分離到桿菌屬細菌，同時包括革蘭氏陽性的芽孢桿菌，還需進一步對這些菌株進行鑒定。

2.3 16S rDNA序列分析

分別以兩組樣品中分離純化到的28株菌株的總DNA為模板，用16S rDNA引物進行PCR擴增，得到片段大約為1500bp的PCR產物，經測序得到各菌株的16S rDNA序列。各序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫Blast比對后，從GeneBank下載親緣關系相近種的模式菌株（或已發(fā)表菌株）序列，基于16S rDNA序列，對28個菌株及下載菌株的16S rDNA序列進行系統發(fā)育分析，以Neighbor-Joining分析法，經過500次計算，得到系統發(fā)育關系樹。

表1 各細菌的菌落特征Table 1 Colony characteristics of the strains

續(xù)表

表2 對照組中分離細菌16S rDNA序列分析Table 2 16S rDNA sequence analysis of bacteria isolated from Control group

將對照組中分離到的14株菌的16S rDNA序列經Blast比對，構建系統發(fā)育樹，根據遺傳距離確定其最相似菌株，結果見表2，圖2表示14株菌的系統發(fā)育分析。

圖2 基于16SrDNA序列同源性的對照組14株細菌系統發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence of 14 strains in Control group

從表2和圖2的結果可以看出，經過16S rDNA鑒定，對照組分離到的14株菌均為嗜中溫菌的腸桿科細菌，包括Pantoea sp.和包括Enterobacter cloacae、Enterobacter ludwigii在內的Enterobacter sp.。其中，A1和A14均為泛團菌屬的一株細菌，與Uncultured Pantoea sp.（HQ616298.1）和Pantoea sp.的相似度為99%以上；A2、A3、A5、A7、A8和A10均屬于陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae（JQ038222.1）），相似度99.95%以上；A4，A6和A11均屬于路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii（JN700134.1）），相似度99%以上；A9、A12和A13均屬于腸桿菌屬的細菌，與Enterobacter sp.（GU808435.1）相似度為99.95%以上。

將白斑組中分離到的14株菌的16S rDNA序列經Blast比對，構建系統發(fā)育樹，根據遺傳距離確定其最相似菌株，結果見表3（其中B3測序失?。?，圖3表示13株菌的系統發(fā)育分析。

表3 白斑組中分離細菌16S rDNA序列分析Table 3 16S rDNA sequence analysis of bacteria isolated from group with white spots

圖3 基于16SrDNA序列同源性的白斑組13株細菌系統發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence of 13 strains in group with white spot

從表3和圖3的結果中可以看出，白斑組測序成功的13株菌主要分為兩類，其中6株在對照組中也分離到，包括Enterobacter ludwigii和Enterobacter cloacae在內的Enterobacter sp.腸桿菌屬細菌，剩余7株為包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在內的芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.），B1、B5和B7與Bacillus cereus（JN400121.1）相似度99.95%以上，屬于蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的一種，B2、B6、B8和B11與Bacillus sp.相似度99%以上，同屬于芽孢桿菌屬。根據以上結果分析，對照組只分離到腸桿菌，而白斑組除了腸桿菌外，還分離得到包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在內的芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.），推測肘花肉制品長白斑可能是由芽孢桿菌引起的。

2.4 生理生化特征

根據16S rDNA序列分析結果，從對照組和白斑中挑選5株細菌進行生理生化特征鑒定，結果見表4。

綜合生理生化特征和16S rDNA鑒定結果，可以進一步確認A7和B9為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），B1和B5為蠟樣芽孢桿菌，B6為其他種的芽孢桿菌。因此，白斑組中存在而對照組沒有的這些芽孢桿菌可能是引起產品長白斑的主要原因。

芽孢桿菌（Bacillus sp.）廣泛存在于自然界中，因此在食品的加工過程中很容易污染食品[7]。芽孢桿菌能利用糖類、蛋白質等營養(yǎng)素成分生長，能形成內生孢子，具有較強耐受力，特別是耐熱力。食品加工中滅菌或熟制工藝難以將芽孢桿菌完全殺滅，使得該屬細菌成為食品工業(yè)中較為重要的微生物研究對象[2]。大量研究也表明芽孢桿菌是肉制品中的常見腐敗菌，具有較強的耐高溫能力。肉制品經過熟制加工后，一般仍有殘留，隨著貯存時間的延長，最終會大量繁殖，進而導致產品的感官質量發(fā)生變化。

錢昆等[2]從低溫熏煮香腸中分離得到一株主要腐敗菌，經過16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；徐世明等[4]通過脹袋烤雞中的腐敗菌相研究，分離出5株腐敗菌，利用生理生化結合16S rDNA序列分析對分離菌株進行鑒定，其中為兩株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和兩株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilu）。有學者研究發(fā)現，蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）和食物長白斑有著直接的關系[8]，蠟樣芽孢桿菌也是一種廣泛存在于土壤、空氣、水和塵埃中的好氣、中溫、產芽孢的桿菌，是食品和化妝品中常見的污染菌[9-10]。董雙品[8]在長有白色斑點的豆腐和水源中均分離出同一種蠟樣芽孢桿菌，從而證明蠟樣芽孢桿菌在污染水源后，在豆腐中繼續(xù)增殖，從而引起豆制品變質，出現白色斑點。肘花產品長白斑引起的腐敗變質是否也是由蠟樣芽孢桿菌引起，或者是其他芽孢桿菌作用的結果，在接下來的研究中，我們將進一步驗證。

表4 菌株的生理生化特征Fig.4 Physiological and biochemical characteristics of the strains

3 結論

本研究通過傳統培養(yǎng)方法從正常組和長白斑的肘花樣品中分別分離到14株細菌，通過分離純化，結合16S rDNA序列分析鑒定，對照正常組主要包括泛團菌屬（Pantoea sp.）和包括Enterobacter cloacae、Enterobacter ludwigii在內的腸桿菌屬（Enterobacter sp）。白斑組組中除了Enterobactercloacae、Enterobacter ludwigii在內的腸桿菌屬（Enterobacter sp）外，還分離出7株包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在內的芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.），因此，推測這些芽孢桿菌可能是引起產品長白斑的主要原因。

本研究對白斑肘花產品中腐敗菌的分離鑒定，將為下一步進行腐敗菌的溯源分析提供依據，為企業(yè)尋找產品污染源頭，在加工過程中加以重點控制，加強產品品質提供保障。

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