張 帥，辛嘉英，2，*，姜加良

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076）

（2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000）

甲烷氧化細(xì)菌（Methanotrophicbaeteria，Methanotrophs）是甲基氧化菌的一個分支，是一類能以甲烷作為唯一碳源和能源生長的微生物。它在自然界普遍存在，在全球甲烷的平衡中起重要作用，從而對調(diào)節(jié)全球氣候變暖發(fā)揮著不可忽視的作用[1]。甲烷氧化細(xì)菌，其獨(dú)特之處在于能利用甲烷作為唯一的碳源和能源。他們能氧化大部分厭氧環(huán)境中產(chǎn)生的甲烷，在不飽和土壤中氧化大量的大氣甲烷。幾乎所有的甲烷氧化菌都是專性甲烷氧化菌，革蘭氏陰性[2]。甲烷氧化菌的典型特征是含有甲烷單氧酶（MMO）[3]，MMO在分子氧的作用下將甲烷氧化為甲醇，甲醇在甲醇脫氫酶的作用下先氧化為甲醛，繼而在甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶的作用下將甲醛進(jìn)一步氧化成CO2和H2O，從而為細(xì)胞代謝提供NADH[4]。甲烷氧化菌于1906年首次被荷蘭微生物學(xué)家Sohngen分離出來[5]。1970年Whittenbury等[6]分離和鑒定了100多種利用甲烷的細(xì)菌，為現(xiàn)代甲烷氧化菌的分類奠定了基礎(chǔ)。本文通過對實(shí)驗(yàn)室分離出的甲烷氧化細(xì)菌M13在甲烷和甲醇不同碳源條件下的研究，了解該產(chǎn)色素細(xì)菌的菌種特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種甲烷氧化細(xì)菌M13 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院從野外土壤中分離出；甲烷、液體甲醇、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4·7H2O、KNO3、NaCl、Na2HPO4·12H2O、EDTA、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeCl3、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·H2O、瓊脂、CAS溶液、CuSO4溶液、HDTMA溶液、結(jié)晶紫、碘液、乙醇、沙黃、萘、萘酚、固藍(lán)B、磷酸緩沖溶液。

DMBA200LED-B數(shù)碼顯微鏡 北京麥克奧迪顯微鏡公司；UV-2550型紫外可見分光光度計 日本島津公司；HNY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；DHP－9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX－50KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；DL－CJ－2ND1潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BSA224S、BSA2202S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甲烷氧化細(xì)菌M13培養(yǎng)基的配制 甲烷氧化細(xì)菌由于能利用甲烷或甲醇為碳源進(jìn)行生長，因此在以甲烷或甲醇培養(yǎng)時，在其液體培養(yǎng)基配方中沒有出現(xiàn)有機(jī)碳源或無機(jī)碳源。碳源以氣體或液體形式單獨(dú)提供。由于目前甲烷氧化細(xì)菌M13自身沒有適合的培養(yǎng)基，所以本實(shí)驗(yàn)采用現(xiàn)有的甲烷氧化細(xì)菌IMV3011的培養(yǎng)基對其進(jìn)行培養(yǎng)，IMV3011的培養(yǎng)基配方如下所示：

A液（g/L）：NH4Cl（0.5），KH2PO4（0.4），K2HPO4（0.4），CaCl2·2H2O（0.02），MgSO4·7H2O（0.3），NaCl（0.3），KNO3（1.0），EDTA（0.01），Na2HPO4·12H2O（0.74），F(xiàn)eCl3（0.001），F(xiàn)eSO4·7H2O（0.004）；

B液（g/L）：MnSO4·5H2O（3×10－4），ZnSO4（3.4×10－4），NaMoO4·2H2O（2.4×10－4）。

1.2.2 甲烷氧化細(xì)菌M13的液態(tài)培養(yǎng) 先將配制好的培養(yǎng)基倒入250mL三角瓶中，放入高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌完畢后，置于無菌操作臺上冷卻并接種，接種量為10%。

1.2.2.1 甲烷作為碳源 以甲烷為碳源培養(yǎng)，需采用抽真空法置換入新鮮的甲烷∶空氣（體積比1∶1）的混合氣，將接好種的三角瓶放入搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃，180r/min，每24h換一次氣，培養(yǎng)時間5、15d，觀察結(jié)果。

1.2.2.2 甲醇作為碳源 以甲醇為碳源培養(yǎng)，每24h加入甲醇一次，添加量為0.01%。培養(yǎng)時間5、15d，觀察結(jié)果。

1.2.3 甲烷氧化細(xì)菌M13的固態(tài)培養(yǎng) 向配制好的培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂，滅菌完畢后，置于無菌操作臺上冷卻。并采用稀釋平板法以1/100和1/1000的菌種濃度進(jìn)行涂布接種，接種量為10%。分別以甲烷和甲醇為碳源進(jìn)行培養(yǎng)，30d后取出培養(yǎng)皿，觀察甲烷氧化細(xì)菌M13的生長及產(chǎn)色素情況。

1.2.4 甲烷氧化細(xì)菌M13細(xì)胞形態(tài)觀察 本實(shí)驗(yàn)采用的是顯微鏡觀察。

將培養(yǎng)好的甲烷氧化細(xì)菌M13革蘭氏染色，并做成水封片，在顯微鏡40倍和油鏡下，對革蘭氏染色后的菌體細(xì)胞進(jìn)行觀察。

1.2.5 不同碳源對甲烷氧化細(xì)菌M13生長情況的影響 按上述方法分別以甲烷和甲醇為唯一碳源對甲烷氧化細(xì)菌M13進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃，180r/min，利用紫外分光光度計測其600nm的OD值，每6h測一次，從而直接反映出M13菌種在兩種不同碳源下的生長情況，并對其生長曲線進(jìn)行記錄與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲烷氧化細(xì)菌M13液態(tài)培養(yǎng)生長情況

取原菌種以10%接種量接種至液態(tài)培養(yǎng)基中，分別在甲烷和甲醇條件下培養(yǎng)5、15d后，觀察菌體形態(tài)及菌液變化，結(jié)果如圖1～圖4所示。

圖1 甲烷為碳源培養(yǎng)5d的菌種Fig.1 M13 with methane as the carbon source after 5 days

圖2 甲醇為碳源培養(yǎng)5d的菌種Fig.2 M13 with methanol as the carbon source after 5 days

圖3 甲烷為碳源培養(yǎng)15d的菌種Fig.3 M13 with methane as the carbon source after 15 days

圖4 甲醇為碳源培養(yǎng)15d的菌種Fig.4 M13 with methanol as the carbon source after 15 days

由圖1～圖4可知，當(dāng)甲烷氧化細(xì)菌M13培養(yǎng)5d后，可以看到菌體已生長，菌液開始變得渾濁，瓶壁上附有菌膜，甚至可觀察到菌苔的形成，此時顏色變化不大；當(dāng)甲烷氧化細(xì)菌M13培養(yǎng)15d后，瓶壁上的細(xì)菌數(shù)量增多，菌苔增厚，同時發(fā)酵液顏色發(fā)生改變，變成淡粉色，表明有色素類物質(zhì)產(chǎn)生。與甲醇相比，甲烷作為碳源顏色變化更加明顯，說明含粉紅色素的菌體細(xì)胞聚集到了一起。

2.2 甲烷氧化細(xì)菌M13固態(tài)培養(yǎng)生長情況

2.2.1 甲烷氧化細(xì)菌M13的菌落形態(tài) 以1/1000濃度的菌液涂布接種，接種量為10%，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，甲烷氧化細(xì)菌M13培養(yǎng)5d后，其菌落較大，呈乳白色，顯圓形，表面光滑明亮。

圖5 甲烷氧化細(xì)菌M13的菌落形態(tài)Fig.5 The colony morphology of M13

2.2.2 甲烷氧化細(xì)菌M13固態(tài)培養(yǎng)30d生長情況 將甲烷氧化細(xì)菌M13菌液稀釋100倍，接種量為10%。分別以甲烷和甲醇為碳源進(jìn)行培養(yǎng)，30d后取出培養(yǎng)皿，結(jié)果如圖6～圖9所示。

圖6 以甲烷為碳源培養(yǎng)5d的M13平板Fig.6 Plating of M13 with methane as the carbon source after 5 days

圖7 以甲烷為碳源培養(yǎng)30d的M13平板Fig.7 Plating of M13 with methane as the carbon source after 30 days

圖8 以甲醇為碳源培養(yǎng)5d的M13平板Fig.8 Plating of M13 with methanol as the carbon source after 5 days

圖9 以甲醇為碳源培養(yǎng)30d的M13平板Fig.9 Plating of M13 with methanol as the carbon source after 30 days

由圖6～圖9對比可以看出，在甲烷為碳源條件下培養(yǎng)的細(xì)菌密度較大，數(shù)量較多，且經(jīng)菌落計數(shù)法計算，菌落數(shù)約為4.4×104cfu/mL。而甲醇為碳源下培養(yǎng)的菌落數(shù)約為5.2×104cfu/mL，表明在固體培養(yǎng)基中，以甲醇為碳源培養(yǎng)甲烷氧化細(xì)菌M13較甲烷中生長更好。經(jīng)30d的培養(yǎng)后，甲烷氧化細(xì)菌M13在甲烷和甲醇條件下均顯粉色，且在甲烷培養(yǎng)中的顏色變化比在甲醇中明顯，說明甲烷培養(yǎng)更適合色素的形成。

2.2.3 甲烷氧化細(xì)菌M13細(xì)胞形態(tài)的觀察 革蘭氏染色后的甲烷氧化細(xì)菌M13菌體細(xì)胞分別在40倍和100倍的顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖10～圖11所示。

圖10 40倍顯微觀察下的M13菌體形態(tài)Fig.10 The cell morphology of M13 with 40×microscope

圖11 100倍顯微鏡觀察下的M13菌體形態(tài)Fig.11 The cell morphology of M13 with 100×microscope

由圖10～圖11可以看出，經(jīng)革蘭氏染色后的菌體細(xì)胞呈紅色，說明甲烷氧化細(xì)菌M13是革蘭氏陰性菌。在甲烷與甲醇兩種不同培養(yǎng)條件下所生長的甲烷氧化細(xì)菌M13菌體形態(tài)大致相同，該菌體細(xì)胞個體均勻，呈短桿狀或略彎多數(shù)為單生。

2.3 不同碳源條件下甲烷氧化細(xì)菌M13生長曲線的分析

分別以甲烷和甲醇為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)，利用紫外分光光度計每隔6h測定其600nm的OD值，對其生長曲線進(jìn)行記錄與分析。結(jié)果如圖12～圖13所示。

圖12 以甲烷為碳源的甲烷氧化細(xì)菌M13的生長曲線Fig.12 The cell growth curve of M13 with methane as the carbon source

圖13 以甲醇為碳源的甲烷氧化細(xì)菌M13的生長曲線Fig.13 The cell growth curve of M13 with methanol as the carbon source

由圖12～圖13可知，在以甲烷和甲醇為碳源的不同培養(yǎng)條件下，甲醇為碳源培養(yǎng)的甲烷氧化細(xì)菌M13進(jìn)入對數(shù)生長期較甲烷早；同時在進(jìn)入穩(wěn)定期后，甲醇為碳源66h的OD600大于甲烷60h的OD600，表明甲烷氧化細(xì)菌M13以甲醇作碳源比甲烷作碳源的生長情況更好，因此甲醇更適合M13的生長和細(xì)胞合成。

3 結(jié)論

本文以甲烷氧化細(xì)菌M13作為研究對象，對其細(xì)胞形態(tài)和菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，并對不同碳源培養(yǎng)下細(xì)胞生長情況進(jìn)行分析、檢測，為今后對這種或者此類的細(xì)菌的進(jìn)一步研究打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。從菌落形態(tài)上看，甲烷氧化細(xì)菌M13菌落較大，呈圓形，乳白色，較為均勻，表面光滑明亮。在甲烷和甲醇條件下培養(yǎng)一段時間均產(chǎn)生粉紅色素，且在甲烷培養(yǎng)中的顏色變化比在甲醇中明顯；從細(xì)胞形態(tài)上看，甲烷氧化細(xì)菌M13的菌體呈短桿狀或略彎，細(xì)菌單生，是革蘭氏陰性菌；從菌體生長情況上看，甲烷氧化細(xì)菌M13在以甲烷和甲醇為碳源的不同培養(yǎng)條件下，甲醇為碳源條件下細(xì)菌生長的對數(shù)期長，甲烷為碳源進(jìn)入穩(wěn)定期比甲醇早，表明甲烷氧化細(xì)菌M13以甲醇作碳源比甲烷作碳源的生長情況好。

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