王春玲，夏焱，張士嬌，王利蕊，曹小紅

天津科技大學食品工程與生物技術學院 教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津 300457

家蠅蛹甘露糖結合凝集素的結構及免疫調節(jié)作用

王春玲，夏焱，張士嬌，王利蕊，曹小紅

天津科技大學食品工程與生物技術學院 教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津 300457

王春玲, 夏焱, 張士嬌, 等. 家蠅蛹甘露糖結合凝集素的結構及免疫調節(jié)作用. 生物工程學報, 2013, 29(5): 601?611.

Wang CL, Xia Y, Zhang SJ, et al. Structure and immunomodulation activity of a novel mannose binding lectin from housefly pupae. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 601?611.

分析了一種分子量為24 kDa，具有免疫活性的新型家蠅蛹甘露糖結合凝集素 (MBL-1) 的結構，為深入研究其結構與功能之間的關系提供依據。首先通過凝膠電泳及Schiff’s染色確定此新型家蠅蛹凝集素具有糖鏈結構。通過β-消除反應、紅外光譜、原子力顯微鏡和蛋白N端測序儀對其結構進行分析。結果表明MBL-1是一種存在N-糖苷鍵，蛋白含量為97.20%、糖含量為2.55%，直徑60～100 nm的橢球狀蛋白單體，肽鏈N-端封閉。MTT實驗證明 MBL-1可以明顯促進巨噬細胞的增殖且具有濃度依賴性，掃描電鏡觀察結果表明，MBL-1作用后的巨噬細胞形態(tài)呈現活化狀態(tài)?？梢?，分離純化出的MBL-1是一種具有明顯的免疫調節(jié)活性的新型凝集素，為開發(fā)天然免疫增強劑和進一步分析其結構及其作用機制提供了參考。

家蠅蛹，凝集素，結構分析，免疫調節(jié)

昆蟲沒有完善統(tǒng)一的免疫體系，缺乏B和T淋巴細胞，但許多昆蟲的抗菌力卻很強。最典型的例子是家蠅，從幼蟲到成蟲出沒于雜菌橫生的環(huán)境，卻不受病原菌的侵襲，其獨特的免疫防御機制已成為國內外研究的熱點[1-4]。

凝集素是一類糖結合蛋白，在家蠅的免疫防御系統(tǒng)中起著重要作用[5-8]。由于家蠅個體較小等原因，導致對其研究大多還停留在免疫應答的誘導、粗提物的理化生物學性質等階段[9-11]。因此對家蠅凝集素進行系統(tǒng)的分離純化、結構分析顯得尤為重要。本文從家蠅蛹體內分離純化出一種具有明顯免疫調節(jié)活性的新型甘露糖結合凝集素，并對其結構和免疫調節(jié)活性進行了研究，為進一步研究其構效關系和揭示家蠅的抗病機理提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

家蠅來自天津市衛(wèi)生疾病防治中心；高速冷凍離心機 (Eppendorf)；凝膠成像儀 (Bio-Rad)；酶聯(lián)檢測儀 (FL340)；紅外光譜 (德國布魯克)；原子力顯微鏡 (JEOL)；蛋白測序儀 (AB I491A)；SU1510掃描電鏡 (日本日立)；CO2培養(yǎng)箱 (Thermo)。

1.2 試劑

考馬斯亮藍 R 2250 (USB)；希夫試劑Schiff’s Reagent (Sigma)；MTT (Sigma)；單糖標準品 (Genview)；其他試劑均為國產分析純。

1.3 家蠅蛹凝集素的分離純化

參照本實驗室前期研究方法[12]粗提家蠅蛹血淋巴，通過Con A-Sepharose 4B親和層析，在親和層析中，先用結合緩沖液以1 mL/min的流速沖洗，直至基線水平為零。將洗脫液換成0.2 mol/L的 D-甘露糖溶液，對凝集素進行解吸附。收集Con A-Sepharose 4B親和層析后的甘露糖洗脫峰，利用DEAE弱陰離子交換層析進行進一步分離純化，梯度洗脫條件依次為：0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.02 mol/L NaCl溶液為梯度洗脫液，每梯度洗脫時間為30 min。利用MTT實驗檢測分離各組分的免疫調節(jié)活性。

1.4 SDS-PAGE電泳

取適量家蠅蛹凝集素加入上樣緩沖液，煮沸5 min，8 000 r/min 離心 5 min，備用。參照SDS-PAGE電泳步驟，采用12%分離膠，5%濃縮膠，蛋白質標準樣與樣品在80 V，2 h條件下電泳。凝膠分別用考馬斯亮藍R 2250和periodic acid-schiff’s (PAS) 染色，糖蛋白染色參考相關文獻方法[13]。

1.5 家蠅蛹凝集素蛋白和糖含量測定

采用考馬斯亮藍G 2250法，以牛血清白蛋白 (BSA) 為標準蛋白。經考馬斯亮藍工作液處理后，檢測595 nm的吸光值，繪制OD595標準蛋白濃度曲線。取1 mg樣品經考馬斯亮藍工作液同樣處理后，測定595 nm處的吸光值，并在標準曲線上找出對應的蛋白質濃度，計算待測樣品的濃度，得出蛋白的含量。

采用苯酚-硫酸法[14]對家蠅蛹凝集素中糖含量進行測定。

1.6 家蠅蛹凝集素的β-消除反應

2 mg家蠅蛹凝集素溶于 2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液中，于45 ℃下保溫30 min。通過全波長掃描測定堿處理前后紫外吸收光譜的變化[15]。

1.7 家蠅蛹凝集素的紅外光譜檢測

稱取1 mg樣品，加入150 mg干燥的KBr粉末，在紅外燈下于瑪瑙研缽中充分研磨均勻，裝入壓片模具中，用油壓機在抽真空狀態(tài)下以27 MPa的壓力壓制2 min，然后用鑷子小心取下厚度約1 mm的壓片，裝入樣品架；將樣品架置于樣品窗口，進行紅外掃描測定。

1.8 原子力顯微鏡 (Atomic force microscope，AFM) 掃描分析家蠅蛹凝集素

取云母片，剪成適宜大小，撕去云母片表層直至出現光亮平整的表面。用超純水配制濃度為50 μg/mL的凝集素溶液，滴加至云母片表面，于干燥器中室溫晾干。原子力顯微鏡下觀察，選擇輕敲模式并記錄結果。

1.9 家蠅蛹凝集素的蛋白N-端測序

10 μg的家蠅蛹凝集素樣品經過SDS-PAGE后顯示為一條較清晰的條帶，經過染色、轉膜等預處理經蛋白質測序儀測定 N-末端氨基酸的序列，采用 Edman降解法[16]，在 ABI PROCISETM494cLC蛋白測序儀中完成序列測定。本過程由中國科學院上海蛋白質組研究分析中心完成。

1.10 家蠅蛹凝集素的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (MALDI-TOF-MS)

電泳后的膠條用胰蛋白酶進行水解，取0.75 μL與基質 (現配現用的 10 mg/mL的 α-氰基-4-羥基肉桂酸) 等體積混合，將其點在靶上，室溫干燥。將靶裝入質譜儀中進行檢測。本過程由上海基康生物技術有限公司完成。

1.11 MBL-1對巨噬細胞增殖及吞噬活性的影響

取96孔板，每孔中加入100 μL的5×105個/mL巨噬細胞懸液。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)貼壁4 h，棄上清，每孔加入不同濃度的MBL-1，每孔終體積為200 μL，MBL-1的終濃度分別為0、5、10、20、40、80 μg/mL，每一濃度6個復孔。并設空白對照組及陽性對照組，陽性對照組加入終濃度為5 μg/mL的脂多糖 (LPS) 。置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，于5%CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h。結束后，棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜 (DMSO)，振蕩10 min，結晶物完全溶解后，測定OD570。

不同濃度的MBL-1處理細胞培養(yǎng)48 h后，棄上清后每孔加入過膜后的100 μL 0.1%中性紅生理鹽水溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，傾去上清，室溫PBS洗滌3遍。然后每孔加入200 μL細胞裂解液 (體積分數為 50%的乙酸和體積分數為 50%的無水乙醇)。室溫靜置1 h，待細胞溶解后檢測OD540。

1.12 MBL-1作用巨噬細胞后的掃描電鏡分析

將無菌處理后的蓋玻片平放于6孔細胞培養(yǎng)板中，加入細胞密度為 1×105/mL的鼠腹腔巨噬細胞，貼壁后加入MBL-1，給藥濃度為40 μg/mL，培養(yǎng)48 h后取出蓋玻片，PBS洗滌2次，用2.5%的戊二醛于4 ℃固定1 h，PBS洗滌3次，1%鋨酸固定1 h，逐級酒精脫水，叔丁醇干燥，離子噴鍍儀噴金后進行掃描電鏡觀察[17]。

2 結果

2.1 家蠅蛹凝集素的分離純化

家蠅蛹經研磨，浸提后進行親和層析，由于D-甘露糖溶液與Con A-Sepharose 4B上結合的凝集素競爭性洗脫，且 D-甘露糖與凝集素結合能力大于Con A-Sepharose 4B，親和組分被洗脫下來。大約在100～108 min時出現洗脫峰，收集洗脫峰，利用10 kDa的濾膜進行超濾處理并低溫冷凍干燥得家蠅蛹凝集素粗品。

通過 SDS-PAGE電泳及高效液相色譜法結果顯示Con A-Sepharose 4B親和層析后的家蠅蛹凝集素粗品成分并不單一，因此通過DEAE弱陰離子層析進行進一步分離純化。分離結果如圖2所示，收集 3個洗脫峰分別命名為 MBL-1、MBL-2、MBL-3，以10 kDa超濾膜進行脫鹽后，低溫冷凍干燥。

圖1 家蠅蛹提取液的Con A-Sepharose 4B親和層析圖Fig. 1 Affinity chromatography of crude extract of Musca domestica pupae on Con A-Sepharose 4B.

圖2 家蠅蛹凝集素分離純化的DEAE-離子交換圖Fig. 2 Anion exchange chromatography of Musca domestica pupae lectin on DEAE-Sepharose.

為進一步確定研究組分，通過 MTT檢測MBL-1、MBL-2、MBL-3三個組分的活性，結果顯示 MBL-1的免疫調節(jié)活性較其他兩個組分要高，因此選擇MBL-1來進行進一步的研究分析。

2.2 MBL-1的電泳分析

MBL-1的 SDS-PAGE電泳檢測結果如圖 3所示，為單一蛋白條帶，說明 MBL-1不含有亞基結構，MBL-1表觀分子質量約為24 kDa。

目前分離到的大多數凝集素都帶有糖鏈，為驗證 MBL-1是否含有糖類成分，對其進行了希夫試劑糖染色實驗。如圖4所示，電泳后凝膠經過希夫試劑染色后，可看到有明顯的紅色，說明MBL-1含有糖鏈，是一種糖蛋白。

2.3 MBL-1的蛋白含量和含糖量測定

圖3 MBL-1的SDS-PAGE電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE electrophoresis of MBL-1. 1:sample in the presence of β-mercaptoethanol; M: protein marker.

圖4 MBL-1 Native-PAGE電泳圖Fig. 4 Native-PAGE electrophoresis of MBL-1. 1:sample stained by CR-250; 2: sample stained by periodic acid-shiff’s reagent.

通過考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒于分光光度計測得空白管OD值為0.258，標準管OD值為0.364，測定管OD值為0.441，計算得出MBL-1蛋白含量為97.20%。

通過苯酚-硫酸法測定MBL-1的含糖量，樣品所測得的吸光度為 0.224，樣品濃度為4 mg/mL，依據標準曲線可以算出MBL-1糖含量為2.55%。

2.4 MBL-1的β-消除反應

形成 O-糖苷鍵的蘇氨酸和絲氨酸上的糖鏈經稀堿處理后很容易解離，且解離后的蘇氨酸和絲氨酸形成α-氨基丁烯酸和α-氨基丙烯酸，這兩種氨基酸衍生物在240 nm均存在特征吸收。沒有和糖鏈相連的蘇氨酸和絲氨酸在經過稀堿處理后則不會形成這兩種氨基酸衍生物，在240 nm處就不會產生特征吸收。而 N-糖苷鍵不會被稀堿從蛋白上解離，因此通過檢測稀堿處理后的蛋白質部分是否含糖，可間接判斷有無 N-糖若鍵的存在[18-19]。結果如圖5所示，與堿處理前相比處理后的 MBL-1的光密度值整體因糖的水解而增加，但在240 nm處并沒有突然明顯的增大趨勢，即未出現羥基不飽和氨基酸的特征吸收，因而可推斷MBL-1中不含O-糖苷鍵，經β-消除反應后的凝集素通過苯酚硫酸法檢測含有糖成分，推斷MBL-1中糖肽的結合方式為N-糖苷鍵。

圖5 NaOH處理前后MBL-1的紫外吸收狀況Fig. 5 UV absorption of MBL-1 before and after treated with NaOH. (A) Before being treated with NaOH. (B) After being treated with NaOH.

2.5 MBL-1的紅外光譜測定

紅外光譜測定結果見圖6，參考文獻[20-21]對其進行分析，3 298 cm-1附近的一個較寬的吸收峰為O-H的伸縮振動吸收峰，且存在著分子間氫鍵；2 962 cm?1附近的一組峰為C-H鍵的特征吸收；1 656 cm?1處較強的吸收峰及1 400 cm?1到1 200 cm?1間一些較弱的吸收是多糖的特征吸收；1 398 cm?1附近的一些峰是C-H的變角振動；1 656 cm?1處較強的吸收峰及1 539 cm?1處較弱的吸收峰為蛋白質的特征吸收，1 600～1 700 cm?1處吸收峰為酰胺Ⅰ譜帶，通過 Peakfit軟件分析其結構主要為β-折疊。

2.6 MBL-1的原子力顯微鏡掃描分析

與紅外光譜、核磁共振、色質聯(lián)用、X射線衍射等現代測試技術相比，原子力顯微鏡可得到上述方法無法獲得的生物大分子表面形態(tài)學直觀信息。原子力顯微鏡掃描結果如圖 7所示，MBL-1為橢球狀蛋白單體，其蛋白直徑約在60～100 nm之間，可能由于糖鏈較短，圖上并不能看到明顯的糖鏈結構。

圖6 MBL-1的紅外光譜分析Fig. 6 IR analysis of MBL-1 sample.

圖7 MBL-1的原子力顯微鏡分析Fig. 7 AFM analysis of MBL-1.

2.7 MBL-1蛋白N-端測序

蛋白質測序儀測得MBL-1的結果如圖8所示，其中圖8B為標準的PTH氨基酸色譜圖，標明了 20種標準氨基酸的保留時間，圖 8A是MBL-1的PTH氨基酸色譜圖，但圖中并沒有出現任何的信號峰，因此，推測MBL-1肽鏈N-端封閉。

2.8 MBL-1的MALDI-TOF-MS檢測

由圖9和表1可知，MBL-1的肽段序列與來源為家蠅的谷胱甘肽硫轉移酶1 (GST-θ) 具有較高的相似性。其分子量為24 kDa，蛋白等電點為7.63。谷胱甘肽轉硫酶是一組多功能同工酶，廣泛分布于哺乳動物、植物、鳥類、昆蟲、寄生蟲及微生物體內，其主要功能是催化某些內源性或外來有害物質的親電子基團與還原型谷胱甘肽的巰基進行偶聯(lián)，通過增加其疏水性使其易于穿越細胞膜。

圖8 MBL-1肽鏈N-末端測定色譜圖Fig. 8 Chromatograms of MBL-1 peptide chain N-terminal. 1: a chromatogram of sample PTH amino acid; 2: a chromatogram of standard PTH amino acid.

圖9 MBL-1的肽指紋圖譜分析Fig. 9 PMF analysis of MBL-1.

表1 肽段匹配表Table 1 Match of peptide sequences from MBL-1

2.9 MBL-1對巨噬細胞增殖及吞噬活性的影響

通過MTT法檢測MBL-1對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活性的影響 (圖10)，不同濃度的MBL-1作用于鼠腹腔巨噬細胞，作用48 h，隨著MBL-1濃度的增加，細胞增殖活性不斷增強，說明在一定范圍內，鼠腹腔巨噬細胞的增殖活性與MBL-1的劑量濃度呈依賴關系。且與空白對照組相比，MBL-1在濃度為 5 μg/mL時對巨噬細胞的增殖即有極顯著的作用。由于80 μg/mL與40 μg/mL時作用效果相差不大，選擇40 μg/mL為最佳作用濃度。

圖10 MBL-1作用濃度對巨噬細胞增殖指數的影響Fig. 10 Effect of MBL-1 concentation on proliferation index of macrophages. LPS (5 μg/mL) as the positive control. 0 μg/mL as a control; ** P≤0.01 vs control group.

通過測定小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力，可以判定 MBL-1對巨噬細胞吞噬能力的影響。如圖11所示，巨噬細胞在MBL-1的作用下，吞噬能力明顯增強，隨著作用濃度的增加，巨噬細胞的吞噬活性也顯著增加。結果表明MBL-1可以刺激小鼠腹腔巨噬細胞，使其進一步分化成熟，吞噬能力明顯增強。

2.10 巨噬細胞在 MBL-1作用后的掃描電鏡分析

圖11 MBL-1作用濃度對巨噬細胞吞噬活性的影響Fig. 11 Effect of MBL-1 concentation on phagocytic activity of macrophages. LPS (5 μg/mL) as the positive control. * P≤0.05; ** P≤0.01 vs control group.

加入40 μg/mL的MBL-1培養(yǎng)48 h后，通過掃描電鏡觀察巨噬細胞的外部形態(tài)，如圖 12所示，MBL-1可以激活巨噬細胞，激活的巨噬細胞和未激活的巨噬細胞之間存在著明顯差異。如圖12A所示，未激活的巨噬細胞一般呈圓形、橢圓形等，鮮少有突起。激活的巨噬細胞體積增大，胞體鋪展，呈橢圓、菱形或梭形等不規(guī)則的形狀，表面突起可呈葉狀或皺摺狀，表現出了更大的膜活性 (圖12B)，實驗結果表明巨噬細胞在MBL-1作用下，外部形態(tài)已經呈現明顯的活化特征。

圖12 MBL-1作用巨噬細胞的電鏡掃描Fig. 12 Scanning electron micrographs of macrophages treated with MBL-1. 1: control group; 2: macrophages treated with 40 μg/mL MBL-1 for 48 h.

3 討論

MBL-1是本研究室分離純化得到的一種具有明顯免疫調節(jié)活性的凝集素，分子量為24 kDa。對兔血紅細胞的凝集效價為 256，其凝血活性在0～40 ℃和pH 6.0～9.0范圍內保持相對穩(wěn)定，D-甘露糖是其凝血活性的糖抑制劑，表明MBL-1是一種 D-甘露糖結合的凝集素。該類凝集素還未見相關報道，因此是一種新型家蠅蛹凝集素。

由于是一種新的凝集素，需要進一步研究其可能的生理功能，因此我們有必要對其結構進行分析。實驗結果表明 MBL-1是一種糖蛋白，分析氨基酸組成的測試是蛋白質化學的重要內容。真核生物中約有80%的可溶性蛋白質是N-末端封閉的，Tasumia等[22]在測定凝集素AJL-1的N-末端序列時也出現了 N端封閉的情況。所謂 N端封閉，僅僅是對 Edman測序原理而言的，常常是由于氨基末端的谷氨酸暴露于酸性環(huán)境中所形成。由于MBL-1的蛋白測序結果為N-端封閉，我們后期擬尋求更合理有效的測序方法，如可將蛋白質化學降解或酶切分離后分析。測得家蠅蛹凝集素的堿基序列后可通過分子生物學方法對其進行克隆，使其在微生物體內表達，省去大規(guī)模飼養(yǎng)和誘導的不便[23]。

糖鏈在其發(fā)揮生理功能方面起著重要作用，結果表明MBL-1是一種存在N-糖苷鍵，原子力顯微鏡掃描結果顯示MBL-1為橢球狀蛋白單體，可能由于糖鏈較短，圖上并不能看到明顯的糖鏈結構。

家蠅缺乏特異性很高的免疫系統(tǒng)，凝集素在其非專一性免疫防御與異體識別機制中起著重要的作用，參與了細胞免疫和體液免疫，與家蠅的抗菌作用密切相關。因此研究家蠅凝集素的免疫調節(jié)活性對于認識家蠅蠅免疫防御的分子機理有著重要意義。巨噬細胞遇到外源性因素作用時其形態(tài)、功能會受到影響[24-25]，MBL-1能夠明顯促進鼠巨噬細胞的增殖，并使巨噬細胞形態(tài)呈現明顯的活化特征，表明其具有較強的免疫調節(jié)活性，至于其具體的免疫調節(jié)作用分子機理，還有待于進一步深入研究。

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Chunling Wang. Tel/Fax:+86-22-60601428; E-mail: wangchunling@tust.edu.cn

Structure and immunomodulation activity of a novel mannose binding lectin from housefly pupae

Chunling Wang, Yan Xia, Shijiao Zhang, Lirui Wang, and Xiaohong Cao

Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science &Technology,Ministry of Education,Tianjin300457,China

We purified a novel mannose binding lectin formMusca domesticapupae by affinity chromatography on Con A-Sepharose 4B and DEAE weak anion-exchange chromatography. By SDS-PAGE, MBL-1 yielded a single band with the molecular weight of 24 kDa. It was a glycoprotein detected by periodic acid-schiff’s staining reaction, with 97.36% protein and 2.1% oligosaccharide. Meanwhile, the results of β-elimination reaction, infrared spectroscopy, atomic force microscopy and protein sequencing instrument show that MBL-1 was an ellipsoidal-shaped monomer with 60?100 nm in diameter.N-glycoside bond linked oligosaccharide chain and the N-terminal blocked peptide chain. Further study suggested that MBL-1 promote the proliferation of macrophage in a concentration-dependent manner. The scanning electron microscope analysis shows that MBL-1 promoted the activation of macrophages. These results show that MBL-1 purified fromMusca domesticapupae possesses immune regulation effect, serving a reference basis to develop natural immune-modulator.

Musca domesticapupae, lectin, structure analysis, immunomodulation

Supported by: Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Twelveth Five-Year Plan Period (No.2012BADB33B04), National Natural Science Foundation of China (No. 31000768).

“十二五”國家科技支撐計劃 (No. 2012BADB33B04)，國家自然科學基金 (No. 31000768) 資助。

時間：2013-04-10 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130410.0950.001.html

(本文責編 郝麗芳)