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        甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和抗褐化研究

        2013-09-03 08:46:24吳轉(zhuǎn)娣劉家勇陳學(xué)寬趙培方李純佳吳才文
        中國糖料 2013年3期
        關(guān)鍵詞:云蔗胚性外植體

        吳轉(zhuǎn)娣 ,趙 俊 ,劉家勇 ,陳學(xué)寬 ,楊 昆 ,趙培方 ,李純佳 ,吳才文

        (1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所,開遠(yuǎn) 616699;2.云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,開遠(yuǎn) 616699;3.云南云蔗科技開發(fā)有限公司,開遠(yuǎn) 616600)

        甘蔗是我國最主要的糖料作物,對(duì)發(fā)展國民經(jīng)濟(jì)有十分重要的意義[1-2]??购祻?qiáng)宿根高產(chǎn)高糖甘蔗新品種的選育對(duì)甘蔗糖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展尤為重要?!笆晃濉币詠?,云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所先后選育并推出了云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗03-258和云蔗05-51等多個(gè)強(qiáng)宿根、高產(chǎn)高糖、抗旱性強(qiáng)的甘蔗新品種。甘蔗組織培養(yǎng)是提高甘蔗繁育效率,降低繁種成本的重要手段,并被廣泛應(yīng)用于研究甘蔗生理、甘蔗快繁、甘蔗突變體育種、病毒去除以及甘蔗轉(zhuǎn)基因研究等?;诟收岵煌蛐推贩N之間的組織培養(yǎng)體系存在較大的差異,本研究以云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗03-258和云蔗05-51為研究材料開展組培快繁研究,旨在研究建立甘蔗新品種(系)的組織培養(yǎng)體系,加快甘蔗新品種的繁殖速度,為蔗區(qū)提供充足的種苗來源,加快其在蔗區(qū)的推廣應(yīng)用與成果轉(zhuǎn)化。

        甘蔗組織培養(yǎng)受到諸多因素的影響。首先,基因型是影響組織培養(yǎng)重要因素之一,不同材料,其培養(yǎng)能力不同。梁計(jì)南等[3]認(rèn)為不同基因型甘蔗在同樣的培養(yǎng)條件下,外植體的褐變率、愈傷組織的誘導(dǎo)率、增殖率、分化率都表現(xiàn)出顯著的差異。黃惠芳等[4]在甘蔗組織培養(yǎng)研究中提出2,4-D是甘蔗愈傷組織誘導(dǎo)中最常用也是效果最好的激素。甘蔗愈傷組織可以在僅含2,4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成;愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)可形成再生植株[5]。本研究為探索誘導(dǎo)4個(gè)不同甘蔗品種產(chǎn)生胚性愈傷組織的最佳2,4-D濃度,使之能夠誘導(dǎo)出較好胚性愈傷組織,為甘蔗的組培快繁和甘蔗轉(zhuǎn)基因研究提供科學(xué)依據(jù)。

        甘蔗是一種含多元酚類物質(zhì)較高的作物,尤其是幼嫩莖和嫩葉鞘含量較高。顧之中等[6]報(bào)道在培養(yǎng)基中添加500mg/L脯氨酸能降低愈傷組織褐變死亡率;陳彪等[7]利用乙烯吡咯烷酮(PVP)做預(yù)處理或作為附加物添加到培養(yǎng)基中防止甘蔗組織培養(yǎng)褐變;秦新民[8]等在培養(yǎng)基中添加抗壞血酸等物質(zhì),在減輕酚污染上取得了一定成效。本研究擬探討有效防止甘蔗組織褐化方法,建立高效甘蔗組織培養(yǎng)體系。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗03-258及云蔗05-51材料采自云南省農(nóng)科院甘蔗研究所所內(nèi)基地。

        1.2 方法

        1.2.1 愈傷誘導(dǎo)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 從田間選取露節(jié)生長健壯、無病蟲害的甘蔗尾鞘約30cm,剝?nèi)ゲ糠掷先~,經(jīng)75%酒精表面消毒后,再剝?nèi)「收犴敹松L點(diǎn)處的幼嫩葉片組織作為外植體。將外植體切成約1mm的薄片,接種于 5個(gè)不同處理的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基的配方為 MS+蔗糖 30g/L+2,4-D(0.5、1.0、1.5、2.0和 2.5mg/L)+卡拉膠8g/L+活性炭0.2g/L,pH5.8。

        每個(gè)培養(yǎng)皿可接入16~20片,3皿為1個(gè)重復(fù),每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù),于25℃下恒溫暗培養(yǎng)。

        1.2.2 抗褐變?cè)囼?yàn)方法 以甘蔗03-258為試驗(yàn)材料,按照1.2.1的方法將甘蔗幼嫩葉切片接種于以下培養(yǎng)基中,每個(gè)培養(yǎng)皿接入16~20片,3皿甘蔗為1個(gè)重復(fù),設(shè)4個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)基配方見表1,其中,無添加培養(yǎng)基A作為對(duì)照,于25℃進(jìn)行恒溫暗培養(yǎng)。計(jì)算6種不同培養(yǎng)基中03-258材料的誘導(dǎo)率。

        1.2.3 觀察、記錄與計(jì)算 以上每5d觀察并記錄各處理的愈傷組織誘導(dǎo)的情況。25d記錄外植體誘導(dǎo)愈傷組織生長狀況,并統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率計(jì)算方法:誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種數(shù)×100%。

        對(duì)誘導(dǎo)出愈傷組織的質(zhì)量進(jìn)行分級(jí),即分為-級(jí)和+級(jí):

        -級(jí):稍有生長或長勢(shì)一般,愈傷組織較小,半透明,愈傷組織松軟、粘糊狀,這類愈傷組織分化出苗率低,不具有胚性能力,無利用價(jià)值。

        +級(jí):長勢(shì)較好,愈傷組織較大且色淡黃、質(zhì)致密,表面光滑,此類愈傷組織叫胚性愈傷組織,具有很好的利用價(jià)值。

        胚性愈傷組織的獲得率=+級(jí)胚性愈傷組織數(shù)/誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)×100%。

        表1 甘蔗03-258抗褐變培養(yǎng)配方

        2 結(jié)果與分析

        2.1 2,4-D對(duì)愈傷組織的影響

        2.1.1 2,4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 以心葉作為外植體,在5個(gè)不同2,4-D濃度下誘導(dǎo)愈傷組織。接種5d左右觀察外植體圓片開始膨大,周邊開始產(chǎn)生顆粒狀的白色愈傷組織,培養(yǎng)7d后看到明顯的愈傷組織團(tuán)狀物,此時(shí)的團(tuán)狀物幾乎布滿整個(gè)外植體圓片。

        試驗(yàn)結(jié)果表明:平均誘導(dǎo)率較高的是云蔗03-194、云蔗05-51和云蔗06-407分別達(dá)59.2%、58.4%和57.3%,而平均誘導(dǎo)率較低的是云蔗03-258,只達(dá)到20.3%(見表2);

        表2 不同基因型、不同濃度2,4-D對(duì)愈傷組織及胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

        通過雙因素方差分析結(jié)果表明:云蔗06-407、云蔗05-51和云蔗03-194三個(gè)品種的愈傷誘導(dǎo)率沒有顯著性差異,而云蔗03-258的誘導(dǎo)率顯著低于其它3個(gè)品種。云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗05-51在不同2,4-D濃度中胚性愈傷組織生長存在差異,最適合它們生長的2,4-D濃度分別為2.0、1.0、1.5mg/L。

        通過雙因素方差分析結(jié)果表明:這3個(gè)品種在2,4-D濃度為1.0、1.5和2.0 mg/L的MS培養(yǎng)基中生長沒有顯著性差異。而在2,4-D濃度為0.5和2.5 mg/L的MS培養(yǎng)基中存在顯著性差異。也就是說2,4-D濃度為0.5和2.5 mg/L的MS培養(yǎng)基不適于這4個(gè)甘蔗品種愈傷組織的生長。

        2.1.2 2,4-D對(duì)愈傷組織生長狀態(tài)及質(zhì)量的影響 不同2,4-D濃度對(duì)愈傷組織發(fā)生速度有不同的影響,誘導(dǎo)形成的愈傷組織塊性狀差異也很大。從表2中可見,較高或較低兩個(gè)處理中+級(jí)胚性愈傷組織所占比例較少,當(dāng)2,4-D濃度在1.0~2.0mg/L時(shí)誘導(dǎo)率較高,+級(jí)的胚性愈傷組織較多。云蔗03-194和云蔗05-51在2,4-D濃度為1.0mg/L時(shí),胚性愈傷組織的質(zhì)量最好,云蔗06-407則在1.5mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中,獲得的胚性愈傷質(zhì)量最好。云蔗05-51在2,4-D濃度為1.5mg/L時(shí),誘導(dǎo)率最高,但是在1.0mg/L 2,4-D培養(yǎng)基中獲得質(zhì)量最好的愈傷組織。在低濃度下獲得最好質(zhì)量的愈傷組織,可以有效地減少變異,因此,我們認(rèn)為最適合云蔗05-51的誘導(dǎo)培養(yǎng)的2,4-D濃度為1.0mg/L。

        雙因素方差分析結(jié)果表明:云蔗03-258與另外3個(gè)品種存在顯著性差異,但未達(dá)到極顯著水平。4個(gè)甘蔗品種在2,4-D為1.0、1.5、2.0mg/L三個(gè)濃度下不存在顯著性差異,但1.0 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基中4個(gè)甘蔗品種均獲得質(zhì)量較好的胚性愈傷組織。

        2.2 不同處理對(duì)云蔗03-258胚性愈傷組織的影響

        2.2.1 對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 在培養(yǎng)基中添加活性炭、PVP、Vc、脯氨酸以及采用液體培養(yǎng)方式進(jìn)行甘蔗抗褐化實(shí)驗(yàn),均能降低愈傷組織褐變。效果最好的是添加了活性炭的培養(yǎng)基B,其誘導(dǎo)率達(dá)到65.3%,+級(jí)的胚性愈傷組織達(dá)到83.5%;添加PVP的培養(yǎng)基C誘導(dǎo)率為62.5%,+級(jí)的胚性愈傷組織達(dá)到82.1%。

        表3結(jié)果表明:培養(yǎng)基中添加活性炭和PVP對(duì)云蔗03-258胚性愈傷組織誘導(dǎo)率效果顯著高于其它培養(yǎng)基,培養(yǎng)基添加Vc、脯氨酸和液體培養(yǎng)方式對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率效果顯著高于不添加抗褐化劑的培養(yǎng)基;而培養(yǎng)基中添加Vc、脯氨酸和液體培養(yǎng)方式對(duì)云蔗03-258愈傷組織誘導(dǎo)率效果差異不顯著。

        2.2.2 對(duì)胚性愈傷組織質(zhì)量誘導(dǎo)的影響 經(jīng)雙因素方差分析表明:培養(yǎng)基中添加活性炭和PVP對(duì)云蔗03-258愈傷組織質(zhì)量誘導(dǎo)的影響效果極顯著高于其它4種培養(yǎng)方式;培養(yǎng)基添加脯氨酸和液體培養(yǎng)方式顯著高于在培養(yǎng)基中添加Vc和無添加培養(yǎng)基。

        綜上所述:在培養(yǎng)基中添加活性炭和PVP對(duì)減輕外植體的褐變較為有效。

        表3 不同處理胚性愈傷組織誘導(dǎo)率

        3 結(jié)論與討論

        為了加快甘蔗新品種的推廣和應(yīng)用,對(duì)甘蔗新品種做高效的組織培養(yǎng)方法是很有必要的。生長素類似物2,4-D在不同濃度下對(duì)甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果有明顯差異,在濃度適合的條件下,甘蔗胚性愈傷組織生長良好。不同基因型甘蔗品種對(duì)2,4-D濃度的要求均不同,因此在大量繁殖過程中,應(yīng)針對(duì)品種篩選出適宜的2,4-D濃度。在獲得相近的誘導(dǎo)效果時(shí),以低濃度為好,這樣可以減少變異的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:云蔗06-407宜采用1.5mg/L 2,4-D,云蔗03-194、云蔗03-258及云蔗05-51則適宜采用1.0mg/L 2,4-D。

        云蔗03-258褐變比較嚴(yán)重,最高誘導(dǎo)率只達(dá)到29.1%,+級(jí)的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率只有52.9%。試驗(yàn)結(jié)果表明,添加活性炭2g/L或1mg/L PVP可以有效地提高云蔗03-258的愈傷誘導(dǎo)率。

        在甘蔗組培苗生產(chǎn)過程中,大多要向培養(yǎng)基中添加抗褐化劑,而以PVP和活性炭使用最多,效果也較好。這兩種試劑成本低廉,方便操作,適用于工廠化育苗。

        [1]輕工業(yè)部甘蔗糖業(yè)科學(xué)研究所,廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院.中國甘蔗栽培學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1985.

        [2]覃蔚謙.甘蔗高產(chǎn)栽培技術(shù)[M].南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社,1998.

        [3]梁計(jì)南,譚中文,譚志勇,等.甘蔗不同基因型組織培養(yǎng)特性的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2002,23(4):37-40.

        [4]黃惠芳.甘蔗組織培養(yǎng)研究綜述[J].廣西熱作科技,1998,67(2):33-37.

        [5]韓光禧、陸耀邦,韋鵬霄,等.甘蔗愈傷組織和胚性細(xì)胞團(tuán)的誘導(dǎo)和分化因素的研究[J].廣西農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1983(2):83-94.

        [6]顧之中,江紹玫,熊友發(fā),等.水稻愈傷組織發(fā)生褐變的影響因素研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1992,14(3):206-211.

        [7]陳彪,陳偉棟,梁鉀賢,等.利用聚乙烯吡咯烷酮防止甘蔗組織培養(yǎng)接種物褐變的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,20(3):63-66.

        [8]秦新民,羅紫娟.甘蔗組織培養(yǎng)中抗酚污培養(yǎng)基篩選[J].廣西甘蔗,1988(1):18-19.

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