耿峻峰 孫晉楓 林強(qiáng) 顧峻 趙仰星 王韋 張紅宇 何英華 余堅(jiān)

(1.上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院胸外科，上海 200030;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院，上海 200032;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院仁濟(jì)醫(yī)院，上海市腫瘤研究所，癌基因及相關(guān)基因國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

近年來(lái)，我國(guó)的肺癌發(fā)病率不斷升高，肺癌的病死率已躍居腫瘤死因之第一位［1］。85%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)［2］。NSCLC患者的預(yù)后主要取決于能否得到早期診斷和治療。據(jù)文獻(xiàn)［3］報(bào)道，ⅠA期 NSCLC患者的 5年生存率達(dá)73%，而ⅢA期NSCLC患者的5年生存率僅為25%。因此，尋找理想的NSCLC生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)NSCLC的早期診斷至關(guān)重要。目前，目標(biāo)基因的甲基化狀態(tài)在腫瘤的早期診斷中已彰顯出優(yōu)勢(shì)［4］。

hedgehog信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視。我們研究了hedgehog信號(hào)通路的3個(gè)負(fù)調(diào)控基因:生長(zhǎng)停頓特異蛋白1(growth arrest specific1，GAS1)、人類hedgehog相互作用蛋白(human hedgehog interacting protein，HHIP)和 patched1(PTCH1)在早期NSCLC患者肺癌組織中的甲基化狀態(tài)，探討它們?cè)贜SCLC早期診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用隨機(jī)數(shù)字表法選取2007—2011年上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院收治的Ⅰ期NSCLC患者85例(NSCLC組)，其中男性66例，女性19例;年齡32～79歲，平均(61.67±9.41)歲;其中鱗癌30例，腺癌51例，腺鱗癌4例。另選同期住院的23例非腫瘤性肺部疾病患者作為對(duì)照組，其中男性17例，女性6例;年齡42～75歲，平均(59.95±9.42)歲;其中肺結(jié)核5例，支氣管擴(kuò)張3例，肺膿腫4例，遷延性肺炎2例，肺硬化性血管瘤3例，肺巨大淋巴結(jié)增生1例，肺錯(cuò)構(gòu)瘤2例，肺隔離癥1例，肺炎性假瘤2例。

1.2 細(xì)胞株 肺腺癌細(xì)胞株 A549(編號(hào):CCL-185TM)、NSCLC細(xì)胞株 NCI-H1299(編號(hào):CRL-5803 TM)以及肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株NCI-H460(編號(hào):HTB-177TM)均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(A-merican Type Culture Collection，ATCC)，肺腺癌細(xì)胞株LTEP-a-2(編號(hào):TCHu 33)及 SPC-A-1(編號(hào):TCHu 53)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

所有肺癌細(xì)胞株均采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2(體積分?jǐn)?shù))、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 采用生物信息學(xué)方法分析hedgehog通路的負(fù)調(diào)控基因在NSCLC全基因組甲基化譜式數(shù)據(jù)庫(kù)中的甲基化狀況 本課題組前期采用Methylcap-seq方法建立了NSCLC及其癌旁組織的全基因組甲基化譜式數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)前期發(fā)表論文［5］。在本研究中，以該數(shù)據(jù)庫(kù)(信息未公開(kāi))信息為基礎(chǔ)，以10kb DNA長(zhǎng)度為窗口顯示范圍，定位于hedgehog通路基因5’端啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島，以甲基化峰值高低作為判斷基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度的標(biāo)準(zhǔn)，峰值高低與甲基化程度正相關(guān)。

1.3.2 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾 (1)提取基因組DNA后，取1 μg DNA，補(bǔ)水至終體積為20 μL;(2)加入3 mol/L氫氧化鈉溶液至質(zhì)量終濃度為0.3 mol/L，混勻后在37℃環(huán)境放置20 min;(3)加入亞硫酸氫鈉230 μL后混勻，加石蠟油覆蓋液面，90℃環(huán)境放置30 min;(4)樣品脫鹽及磺酸根置換采用博大泰克生物科技有限公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒，吸去石蠟油后，加入500 μL溶膠液，混勻后過(guò)柱，用漂洗液漂洗1次，然后加入0.3 mol/L氫氧化鈉溶液(含50%乙醇)300 μL，在室溫放置15 min，9000 r/min離心30 s，去除廢液，漂洗液漂洗2次;(5)用200 μL TE緩沖液洗脫后，保存于-20℃。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)及合成 采用MethPrimer軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海賽百盛生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3.4 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylationspecific polymerase chain reaction，MSP)方法 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán);72℃完全延伸1 min。MSP結(jié)束后，將產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，并選擇有代表性的條帶割膠回收后，作T-A克隆并送上海杰李生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hedgehog通路的負(fù)調(diào)控基因在NSCLC全基因組甲基化譜式數(shù)據(jù)庫(kù)中的甲基化狀況 生物信息檢索結(jié)果顯示，與NSCLC癌旁組織相比，GAS1、HHIP和PTCH1在NSCLC癌組織中均呈不同程度的高甲基化狀態(tài)，見(jiàn)圖1。hedgehog負(fù)調(diào)控基因在NSCLC細(xì)胞株中的甲基化狀態(tài)，見(jiàn)表2。

表1 引物序列

圖1 NSCLC癌組織及癌旁組織的全基因甲基化組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中hedgehog信號(hào)通路負(fù)調(diào)控基因的甲基化狀態(tài)

表2 NSCLC細(xì)胞株中各基因的甲基化狀態(tài)

2.2 hedgehog負(fù)調(diào)控基因在NSCLC組及對(duì)照組中的甲基化狀態(tài) 2組部分患者DNA樣品的MSP產(chǎn)物的電泳情況見(jiàn)圖2。

統(tǒng)計(jì)分析顯示，GAS1、HHIP和 PTCH1在NSCLC組的甲基化率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這3個(gè)基因的甲基化檢測(cè)用于診斷臨床Ⅰ期NSCLC的敏感性和特異性見(jiàn)表3。

圖2 2組部分患者M(jìn)SP產(chǎn)物的電泳圖

表3 GAS1、HHIP和PTCH1的甲基化檢測(cè)用于診斷Ⅰ期NSCLC的敏感性和特異性

3 討 論

hedgehog信號(hào)通路參與發(fā)育過(guò)程中許多生長(zhǎng)及分化過(guò)程的調(diào)控，是進(jìn)化中最保守的信號(hào)途徑之一，GAS1、HHIP和PTCH1是該信號(hào)通路中的3個(gè)負(fù)調(diào)控基因［6］。hedgehog信號(hào)通路的異常不僅與出生缺陷、肥胖等多種發(fā)育異常相關(guān)，而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。hedgehog信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系最早在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中被證實(shí)［7］，其后多項(xiàng)研究［8-10］表明，它與肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等許多腫瘤相關(guān)。

一般認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生主要是由于致癌因素造成DNA序列變異而致細(xì)胞生長(zhǎng)、分化失控。近年來(lái)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)DNA序列改變以外的調(diào)控機(jī)制異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中更為普遍和重要，這種不依賴于DNA序列變化的可遺傳的調(diào)控機(jī)制被稱為表觀遺傳學(xué)機(jī)制，包括組蛋白乙?；?、DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、microRNA以及非編碼長(zhǎng)RNA的調(diào)控等，其中以DNA甲基化在腫瘤中的研究最為深入和廣泛。抑癌基因、DNA修復(fù)基因、細(xì)胞周期控制基因和抗凋亡基因等一些在正常細(xì)胞中處于低甲基化狀態(tài)的基因常被發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)異常高甲基化狀態(tài)而轉(zhuǎn)錄失活，據(jù)此考慮其參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展或?qū)е履[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失控。近年來(lái)，隨著DNA甲基化在基因?qū)用?、全基因組層面以及功能調(diào)控領(lǐng)域的廣泛研究，DNA甲基化在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。

我們前期應(yīng)用Methylcap-seq技術(shù)建立了NSCLC全基因組甲基化譜式。本研究我們?cè)谇捌诠ぷ鞯幕A(chǔ)上采用生物信息學(xué)分析GAS1、HHIP和PTCH1的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，3個(gè)基因在NSCLC中呈異常甲基化。采用MSP方法進(jìn)一步分析3個(gè)基因在肺癌細(xì)胞株基因組DNA中的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除在NCI-H1299中3個(gè)基因均呈去甲基化狀態(tài)以外，在其他4個(gè)腫瘤細(xì)胞株中均有1～2個(gè)基因呈甲基化狀態(tài)。隨后，對(duì)3個(gè)基因在85例臨床Ⅰ期NSCLC癌組織和23例非腫瘤肺部疾病組織中的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，3個(gè)基因在NSCLC組中的甲基化率與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示GAS1、HHIP和PTCH1在臨床Ⅰ期NSCLC中均表現(xiàn)為異常高甲基化。由此推斷，hedgehog信號(hào)通路中的這3個(gè)基因的異常高甲基化以及失活是NSCLC發(fā)生的早期事件。hedgehog信號(hào)通路的異常激活及其下游的一系列信號(hào)通路的異?？赡苁荖SCLC發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因素。

綜上所述，GAS1、HHIP和 PTCH1在臨床Ⅰ期NSCLC肺癌組織中均存在顯著異常甲基化，這可能是hedgehog通路被異常激活的重要因素。對(duì)這3個(gè)基因在早期NSCLC患者血漿游離DNA中的甲基化狀態(tài)的進(jìn)一步闡明，并進(jìn)行大樣本量的臨床試驗(yàn)，那么，這有望為NSCLC的早期診斷提供新的腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)志物。

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