舒曉亮，李 杰，楊愛梅，丁美月

（湖南省懷化市畜牧水產(chǎn)局，湖南懷化418100）

H7N9型禽流感是一種新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)。隨后在北京、江蘇、浙江、山東、河南、臺灣、福建、河北等地陸續(xù)出現(xiàn)H7N9患者[1]。截至2013年7月20日，全國內(nèi)地共報告人感染H7N9禽流感病例134例，死亡37人。

H7N9禽流感病毒屬于甲型流感病毒，其中“H”是指流感病毒血凝素蛋白（HA），可分為1～16種亞型，“N”是指病毒神經(jīng)氨酸酶蛋白（NA），可分為1～9種亞型，HA不同亞型可以與N A的不同亞型相互組合形成不同的流感病毒[2]。

截至2013年5月22日，全國各級獸醫(yī)實驗室共檢測完成899758份樣品，其中，血清學(xué)樣品702369份，病原學(xué)樣品197389份。樣品覆蓋全國31個省份和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團的42250個監(jiān)測采樣場點。各地沒有從家禽養(yǎng)殖場分離到H7N9禽流感病毒，也未發(fā)現(xiàn)豬感染該病毒[3]。

2013年4～5月份，我們通過對懷化地區(qū)105個檢測點采樣1462份進行檢測，初步掌握了我市H7N9禽流感的感染情況，為我市H7N9禽流感的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 樣品主要來源

對懷化市1 3個縣（市、區(qū)）的部分活禽交易市場和養(yǎng)禽場（村）采集禽血清、咽喉和泄殖腔拭子，編號一一對應(yīng)。具體見表1。

1.1.2 主要試劑

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H 7亞型血凝抑制試驗檢測試劑盒購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號：2013003）；H5N1血凝抑制試驗檢測試劑盒購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號：2013001）；H7N9RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號：AIVH720130418P）；采集兩只未免疫公雞紅細胞配成1%雞紅細胞懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 血清學(xué)檢測方法

采用血凝抑制（H I）試驗，檢測血清中H 7亞型禽流感病毒血凝素抗體。具體操作參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T18936-2003）中 H I試驗進行[4]。

共檢測血清樣品1462份，其中雞血清樣品820份、鴨血清樣品390份、鵝血清樣品220份、鵪鶉血清樣品32份。HI試驗檢測抗體水平≥24，結(jié)果判定為陽性。對結(jié)果呈陽性的樣品，取對應(yīng)編號的咽喉和泄殖腔拭子進行RT-PCR檢測。

1.3 H7N9 RT-PCR檢測方法

采用農(nóng)業(yè)部推薦的RT-PCR檢測方法，取H7亞型禽流感病毒血凝素抗體結(jié)果呈陽性的30份樣品對應(yīng)編號的咽喉和泄殖腔拭子做R T-P C R檢測。具體操作按照推薦試劑（盒）的使用說明進行。

1.4 H7N9與H5N1抗體效價比較試驗

采用H I試驗，同時檢測血清中H 7和H 5亞型禽流感病毒血凝素抗體。具體操作參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T18936-2003）中HI試驗進行。共檢測血清樣品30份，全部為H7亞型禽流感抗體檢測陽性血清，其中雞血清樣品22份、鴨血清樣品8份。檢測H7N9抗體效價高低是否與H5N1抗體效價存在關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 H7N9血清學(xué)檢測結(jié)果

通過H7N9HI試驗，檢測出活禽交易市場雞血清樣品陽性率為1.15%，鴨血清樣品陽性率為1.54%；雞養(yǎng)殖場（村）血清樣品陽性率為3.39%；鴨養(yǎng)殖場（村）血清樣品陽性率為2.31%；鵝養(yǎng)殖場（村）和鵪鶉養(yǎng)殖場（村）均未檢出陽性。其中雞血清樣品平均陽性率為2.68%，鴨血清樣品平均陽性率為2.05%。具體見表2。

2.2 H7N9 RT-PCR檢測結(jié)果

取H7亞型禽流感病毒血凝素抗體結(jié)果呈陽性的3 0份樣品對應(yīng)編號的咽喉和泄殖腔拭子做R T-PCR檢測，結(jié)果全部為陰性。陽性對照在634bp出現(xiàn)明顯條帶。詳見圖1。

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2.3 H7N9與H5N1抗體效價比較結(jié)果

H7N9與H5N1抗體效價比較結(jié)果見表3。從圖2可以看出，30份H7N9抗體陽性血清檢測H 5 N 1抗體均為陽性，且效價大部分均在Log7以上。且H5N1抗體效價越高，H7N9抗體效價就越高。

3 分析與討論

通過H7N9血清學(xué)檢測可以從市場和養(yǎng)殖場血清樣品中檢測出H 7亞型禽流感病毒血凝素抗體陽性樣品。但不能確定禽群已經(jīng)感染H7N9禽流感病毒。根據(jù)《農(nóng)業(yè)部印發(fā)H7N9禽流感緊急監(jiān)測方案及應(yīng)急處置指南》文件要求，H7亞型禽流感病毒血凝素抗體陽性樣品需要進一步通過H7N9RT-PCR或熒光RT-PCR檢測才能確定為疑似陽性。通過H 7N9RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，30份血清學(xué)檢測呈陽性的拭子樣品檢測結(jié)果全部為陰性，說明并未感染H7N9禽流感病毒。H7亞型禽流感病毒血凝素抗體陽性樣品可能是由感染其他H7亞型禽流感病毒引起的。說明懷化市暫時未發(fā)現(xiàn)有H7N9禽流感流行，初步掌握了懷化市H7N9禽流感的流行情況。

從圖2可以看出，H5N1抗體效價越高，H7N9抗體效價就越高，說明H5N1和H7N9禽流感病毒存在一定的抗原交叉反應(yīng)，具體情況還有待進一步的研究分析。從表2可以看出，規(guī)模養(yǎng)殖場血清樣品H7N9禽流感陽性率明顯高于活禽交易市場（規(guī)模雞場：3.3 9%>1.1 5%；規(guī)模鴨場：2.3 1%>1.5 4%,），這也與規(guī)模養(yǎng)殖場能很好地進行H5N1禽流感免疫有關(guān)，另外，規(guī)模雞場比規(guī)模鴨場血清樣品H7N9禽流感陽性率要高也能說明這一點（3.3 9%>2.3 1%）。

盡管目前H7N9在人群中流行已經(jīng)減弱，但我們對禽流感病毒檢測和監(jiān)測工作不能放松。新近研究表明，H7N9在哺乳動物貂和豬中具有一定的傳染性[5]，另外，7月20日，在河北省新確診一例人感染H7N9禽流感病例，都提示我們應(yīng)該進一步加強H7N9禽流感病毒監(jiān)測工作。按照農(nóng)業(yè)部新出臺的農(nóng)醫(yī)發(fā) [2013]28號文件要求，新一輪關(guān)于H7N9禽流感病毒的監(jiān)測工作正在開展，將進一步對懷化市H7N9禽流感病毒的流行情況進行調(diào)查，為廣大養(yǎng)殖戶對H7N9禽流感病毒的防控提供依據(jù)。

[1]張 寶，黃克勇，郭勁松，等.H7N9病毒的來源和重組模式[J].J South Med Univ,2013,33(7):1017-1021.

[2]朱聞斐，高榮保，王大燕，楊磊，朱云，舒躍龍.H7亞型禽流感病毒概述[J].病毒學(xué)報，2013,29:245-249.

[3]H7N9禽流感監(jiān)測工作完成未從家禽養(yǎng)殖場分離到H7N9禽流感病毒[N].中華人民共和國農(nóng)業(yè)部辦公室,2013-05-23.http://www.moa.gov.cn/zwllm/zwdt/201305/t20130523_3471497.htm

[4]GB/T 18936-2003，高致病性禽流感診斷技術(shù)[S].

[5]Zhu H,Wang D,Kelvin DJ,et al.Infectivity,transmission,and pathology of human H7N9 influenza in ferrets and Pigs[J].Science,2013,PMID:23704376.