周國保 張文清

(1.江西省化學(xué)工業(yè)學(xué)校，江西 南昌 330012;2.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

1 引言

淫羊藿是一種全草類藥材，其中有效成分為黃酮類化合物，這類化合物總稱為“淫羊藿總黃酮”，含量約1.01% ～ 8.81%［1］，藥典［2］規(guī)定“不得少于 5.0%”。利用淫羊藿總黃酮提取物開發(fā)新藥，具有廣闊的應(yīng)用前景。淫羊藿總黃酮的提取方法主要有水提法或醇提取法，提取輔助手段包括高壓、超聲波，以及微波［3］等。本課題主要針對醇提法提取過程，研究并確定微波輔助條件下的工藝條件和提取效果。

2 試劑和儀器

2.1 試劑

無水乙醇(AR)，天津大茂化學(xué)試劑廠;甲醇(AR)，江西同盟試劑化工廠;乙腈(色譜級)，上海陸忠工貿(mào)有限公司;淫羊藿苷(Icariin)化學(xué)對照品，批號∶110737－200312、110956－200312，中國藥品生物制品檢定所;淫羊藿原料，“奇珍”牌淫羊藿飲片，生產(chǎn)批號∶2005091701，徽滬譙中藥飲片廠出品，原料產(chǎn)地∶江西;種類∶朝鮮淫羊藿。

2.2 儀器

超聲波清洗器，TH－300BQ;蒸餾水裝置，自備;紫外可見光分光光度計，T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;高效液相色譜儀，島津LC－20AT配SPD－20A紫外檢測器;微波爐，家用格蘭士微波爐WP700(21)，功率700W，頻率2450MHz，自改造;真空干燥器，DZF6020，南京神威制藥設(shè)備有限公司。

3 淫羊藿原料及提取物中有效成分的分析方法

淫羊藿原料及提取物中有效成分的分析涉及淫羊藿總黃酮含量和淫羊藿苷含量。參照藥典2010版中“淫羊藿”藥材標(biāo)準(zhǔn)中［含量測定］項下總黃酮測定的規(guī)范，使用紫外－可見光分光光度法，檢測波長為270nm，以淫羊藿苷為對照品，采用外標(biāo)法可測定總黃酮含量。參照藥典2010版中“淫羊藿”藥材標(biāo)準(zhǔn)中［含量測定］項下淫羊藿苷的測定規(guī)范，使用高效液相色譜法，C18柱，以乙腈－水(30∶70)為流動相，檢測波長為270nm，以淫羊藿苷為對照品，采用外標(biāo)法可測定總淫羊藿苷含量。

3.1 總黃酮含量分析

測定條件∶10mm厚石英比色皿，以甲醇為參比溶液，檢測波長270nm?？傸S酮標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C=27.296A－0.573。吸光度A與濃度 C的線性關(guān)系良好，線性范圍∶4.16～20.8μg/mL。根據(jù)吸光度 A 和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計算得到試樣中總黃酮的濃度C。

3.2 淫羊藿苷分析

測定條件∶色譜柱 kromasil C184.6×250mm，檢測波長270nm，流動相乙腈∶水(30∶70)，流速為1mL/min，進(jìn)樣量20μL。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于1500。以淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，HPLC峰面積為縱坐標(biāo)，在色譜工作站中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍∶19.6～98.0μg/mL，淫羊藿苷峰面積 A 與濃度 C 的線性關(guān)系良好。根據(jù)HPLC峰面積，由色譜工作站再解析(外標(biāo)法)，可得到試樣中淫羊藿苷的濃度C。

參照藥典2010版中“淫羊藿”藥材標(biāo)準(zhǔn)中［含量測定］項下總黃酮測定的規(guī)范和淫羊藿苷的測定規(guī)范，取淫羊藿飲片粉末(過三號篩)0.2g左右，從制樣開始，到對供試品溶液的測定。重復(fù)三次。測得淫羊藿飲片中總黃酮含量為3.76%，淫羊藿苷含量0.56% 。

3.3 提取物中有效成分的分析方法

(1)干浸膏中有效成分的分析

取干浸膏10mg左右，干燥至恒重，精確稱重，于10mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，得到淫羊藿苷測定的供試品溶液，可用于淫羊藿苷含量測定。取淫羊藿苷測定的供試品溶液2mL或3mL或4mL，于10mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得總黃酮測定的供試品溶液，可用于總黃酮含量測定。

(2)提取液中有效成分的分析

量取一定量試樣溶液于10mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，得淫羊藿苷測定的供試品溶液(介于 19.6 ～98.0μg/mL)，可用于淫羊藿苷含量測定。再取淫羊藿苷測定的供試品溶液一定量，于10mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得總黃酮測定的供試品溶液(介于4.16 ～20.8μg/mL)，可用于總黃酮含量測定。

4 微波輔助提取的實驗方法

4.1 提取預(yù)實驗

為選取提取溶劑的濃度，安排提取預(yù)實驗。

(1)提取設(shè)備

微波輔助提取設(shè)備利用家用微波爐進(jìn)行改造。

(2)預(yù)實驗中提取過程

稱取片狀淫羊藿飲片10g，粉碎，放入三口燒瓶。考察不同溶劑水、55%乙醇溶液(v%)、65%乙醇溶液(v%)、75%乙醇溶液(v%)的提取效果，溶劑體積為100ml。微波爐功率為27%*700W，微波下提取時間為30min。提取液過濾、濃縮，直到瓶中殘液剩下20ml左右，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶，75%乙醇溶液稀釋至刻度，得到50mL定容液。取樣分析其中總黃酮和淫羊藿苷的含量。

4.2 微波提取與傳統(tǒng)工藝比較實驗

在該研究步驟中，欲采用正交試驗考察有無微波輔助和不同粗細(xì)試樣情況下的提取效果，水平設(shè)計如表1所示。實驗可采用L4(23)表進(jìn)行，如表2所示。

提取過程∶10.0g試樣重復(fù)提取兩次，第一次所用溶劑為140mL的乙醇溶液(濃度按預(yù)實驗結(jié)果優(yōu)選)，第二次所用溶劑為100mL的乙醇溶液;每次提取時間為30min。若采用微波輔助則加熱功率定為27%×700W。若不采用微波輔助則使用電熱套加熱。均在回流下提取。細(xì)的試樣采用粉碎機打碎，粗的試樣只用粉刀粉細(xì)。所得提取液分別75%乙醇溶液定容于50ml容量瓶，得到50mL定容液。

表1 比較試驗中各因素的水平

表2 L4(23)實驗設(shè)計

4.3 微波輔助提取優(yōu)化實驗

在文獻(xiàn)［3］中，研究了微波輔助水提淫羊藿有效成分的過程，認(rèn)為提取收率與預(yù)處理過程潤濕劑種類、濃度、用量、潤濕時間、潤濕后微波輻射時間、提取中水用量、微波提取時間等因素有關(guān)。

本研究在確定溶劑、原料粗細(xì)及輔助手段等因素下，主要從溶劑用量、微波輻射時間、微波提取時間、提取次數(shù)等4個因素進(jìn)行考察，優(yōu)化工藝條件。由于考察因素包括4個因素，因而采用L9(34)正交試驗方案，各因素的水平確定如表3。正交試驗表采用L9(34)，正交試驗設(shè)計，如表4所示。

表3 L9(34)正交試驗中各因素的水平

表4 L9(34)正交試驗設(shè)計

3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1

提取過程∶10.0g試樣放入三口燒瓶，裝入微波爐，用微波輻射預(yù)處理設(shè)定的時間。在該三口燒瓶中加入定量的溶劑(按正交設(shè)計，溶劑濃度由預(yù)實驗優(yōu)選)，微波功率27%*700W，時間定于設(shè)定的提取時間刻度上，重復(fù)提取設(shè)計規(guī)定的次數(shù)。濾液收集、合并。濾液濃縮直到瓶中殘液剩下20ml左右，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶，用75%乙醇溶液定容至50mL(5 mL/g淫羊藿飲片)。

5 提取工藝研究結(jié)果與討論

5.1 預(yù)實驗中結(jié)果與討論

在預(yù)實驗中，分別測定提取液中的總黃酮和淫羊藿的含量，并計算在淫羊藿飲片中的百分含量，結(jié)果分別列于表5。

表5 不同提取溶劑對提取效果的影響

表5中的結(jié)果表明，水作溶劑時提取效果不如水醇(乙醇溶液)作溶劑的提取效果。不同乙醇溶液作溶劑提取效果不同，以65%乙醇溶液最好。提取溶劑選65%乙醇溶液。

5.2 比較實驗中結(jié)果與討論

比較實驗結(jié)果，如表6所示。

表6 比較試驗的結(jié)果

(1)比較實驗結(jié)果分析

FA=6775.2 ＞161.0=F1－α(FA，fe)，因素 A(有無微波輔助)作用顯著;

FB=308 ＞161.0=F1－α(FB，fe)，因素 B(試樣粗與細(xì))作用顯著。

(2)比較實驗結(jié)論與討論

①微波輔助提取工藝比傳統(tǒng)的回流提取工藝效果更好

按綜合評分的方差分析，因素A(有無微波輔助)在顯著水平α=0.05下，作用顯著。因而，淫羊藿總黃酮及淫羊藿苷的提取工藝中采用微波輔助更好。

②藥材原料粗細(xì)對提取效果影響不大，但適當(dāng)粉碎更好

按綜合評分的方差分析，因素B(試樣粗與細(xì))在顯著水平α=0.05下，作用顯著。因而對藥材原料粉碎，不僅有利于有效成分收率提高，而且有利提取設(shè)備容積利用率提高。

5.3 優(yōu)化實驗中的結(jié)果與優(yōu)化條件

根據(jù)優(yōu)化實驗的過程和方法，進(jìn)行正交試驗，并對9次試驗的50mL定容液分別測定淫羊藿苷濃度和總黃酮含量并計算收率，結(jié)果列于表7。

表7 優(yōu)化實驗中正交試驗的結(jié)果

(1)優(yōu)化實驗的結(jié)果分析

根據(jù)綜合評分的方差分析，因素A、因素D作用顯著。最優(yōu)水平組合為［A3，(B2)，(C2)，D3］，即溶劑用量(65%乙醇溶液體積，mL)為飲片重量(g)的14倍(第二、三為12倍)，微波輻射時間為1.5min，微波提取時間為20min，提取次數(shù)為3次。

(2)優(yōu)化實驗的優(yōu)化工藝條件

綜合考慮，在微波輔助提取下，淫羊藿總黃酮提取的最佳工藝條件∶溶劑用量(65%乙醇溶液的體積，mL)為飲片重量(g)的14倍(第二、三次為12倍)，微波提取時間為20min，提取次數(shù)為3次。飲片需要被粉碎，使之變小。

6 結(jié)論

(1)比較了水提、55%(v%)乙醇溶液提取、65%(v%)乙醇溶液提取、75%(v%)乙醇溶液對淫羊藿總黃酮的提取效果，65%(v%)乙醇溶液提取率最高。

(2)比較了微波輔助和無微波輔助、不同粗細(xì)原料的提取過程，微波輔助提取率高，原料粗細(xì)影響不大。

(3)在微波輔助提取下，最佳工藝條件∶以65%乙醇為提取溶劑，提取三次，各次溶劑用量(ml)與飲片重量(g)比為 1∶14、1∶12、1∶12，每次微波提取時間為20min。

(4)根據(jù)驗證實驗，在微波輔助提取的最佳工藝條件下所得的提取液中總黃酮對原料飲片的收率為4.58%，淫羊藿苷對原料飲片的收率為0.88% 。獲得的淫羊藿干浸膏對淫羊藿原料的平均收率10.7%，其中總黃酮含量29.7%，淫羊藿苷含量2.54% 。

［1］李薇.常用中藥薄層色譜鑒定［M］.北京∶化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［2］國家藥典委員會.中人民共和國藥典2010版(一部)［S］.北京∶中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［3］黃瑞華.微波輔助水提淫羊藿有效成分的研究［D］.上?！萌A東理工大學(xué)，2004.