羅志堯，陳天來

（1.興寧市葉塘鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，廣東 梅州 514528；2.廣東省興寧市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

奶牛隱性乳房炎是微生物感染后或理化刺激引起的一種隱性的乳腺炎癥，如果不及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療，將很快發(fā)展成臨床型乳房炎，是造成奶牛損失最嚴(yán)重的疾病之一。全世界2.2億頭奶牛中約有1/3的奶?；几鞣N類型的乳房炎，而隱性乳房炎約占奶牛乳房炎總數(shù)的1/2，不僅嚴(yán)重影響產(chǎn)奶量（可降低產(chǎn)奶量10%～15%）[1]，而且影響乳的品質(zhì)，以至危及人的健康。引起奶牛隱性乳房炎的主要原因是感染病原微生物，包括多種細(xì)菌、真菌、病毒、霉形體等，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主，這三種菌引起的隱性乳房炎占隱性乳房炎總數(shù)的90%以上[2]。但是各地奶牛隱性乳房炎的病原感染情

況不盡相同，因地理環(huán)境、衛(wèi)生條件、飼養(yǎng)方式和氣候條件不同而有差異[3～5]。根據(jù)近幾年文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示大腸桿菌引起的奶牛隱性乳房炎正在迅速增加，現(xiàn)已占隱性乳房炎總數(shù)的47%以上。目前，國(guó)內(nèi)外仍主要采用抗生素療法，但由于抗生素的大量使用及濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)而降低了療效，而且使奶中抗生素的殘留量增加，危及人類健康[6，7]。為此，對(duì)廣東省梅州市5個(gè)奶牛場(chǎng)2052頭奶牛的奶樣進(jìn)行了隨機(jī)抽樣檢測(cè)，并對(duì)隱性乳房炎進(jìn)行了大腸桿菌分離、鑒定和藥敏試驗(yàn)，對(duì)于篩選敏感藥物、預(yù)防和治療各類型乳房炎具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

1.1.1 培養(yǎng)基。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、吲哚試劑、Barritt 氏V.P 試劑、革蘭氏染液、美蘭染液。

1.1.2 藥敏紙片。（見表1）

表1 藥敏紙片及生產(chǎn)廠家

1.1.3 隱性乳房炎診斷液。診斷液為加州隱性乳房炎診斷液（CMT 診斷液，中國(guó)農(nóng)科院中獸醫(yī)研究所藥廠）。

1.1.4 試驗(yàn)取樣牛場(chǎng)。（見表2）

表2 試驗(yàn)取樣牛場(chǎng)的養(yǎng)殖數(shù)量

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 隱性乳房炎的檢測(cè)（CMT 實(shí)驗(yàn)）。按照說明書操作。

1.2.2 奶樣采集。將CMT 檢測(cè)陽性牛進(jìn)行無菌采樣。采樣前用溫水清洗乳房，擦干后先用碘酊消毒，再用75%酒精進(jìn)行脫碘，擠去頭2～3 把奶后，每個(gè)乳區(qū)采集奶樣約5mL 于滅菌的青霉素小瓶?jī)?nèi)，貼好標(biāo)簽，4℃保存，6h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大腸桿菌分離。

1.2.3 大腸桿菌的分離。用滅菌棉簽取隱性乳房炎陽性乳樣接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h 后，挑取平板上形態(tài)不同的菌落分別進(jìn)行美蘭染色，100倍鏡檢，區(qū)別出桿菌和球菌，再用接種環(huán)挑取桿菌菌落劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，置37℃溫箱中培養(yǎng)18～24h 后，挑取3～5個(gè)符合大腸桿菌生長(zhǎng)特性（粉紅色的菌落）的菌落，分別經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)后，革蘭氏染色、100倍鏡檢，符合大腸桿菌形態(tài)特征的菌經(jīng)純化后接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24h 后，放置4℃冰箱保存。

1.2.4 生化鑒定

1.2.4.1 甲基紅（M.R）試驗(yàn)。將分離所得菌株接種于裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中，置37℃恒溫箱培養(yǎng)48～72h 后。取出，沿管壁加入M.R.試劑5 滴，觀察是否變色。若培養(yǎng)液由原來的橘黃色變?yōu)榧t色判為陽性。

1.2.4.2 乙酰甲基甲醇（V.P）試驗(yàn)。將菌株接種于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中，置37℃恒溫箱培養(yǎng)48～72h。無菌吸出培養(yǎng)物1mL 置另一試管，先加入0.6mL 5%的α－萘酚溶液，再迅速加入40%的KOH溶液0.2mL，用力振蕩后，放37℃恒溫箱保溫10～15 min。培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色判為V.P 陽性。

1.2.4.3 吲哚試驗(yàn)。將菌株接種于蛋白胨培養(yǎng)基中，放置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～48h 后，沿管壁慢慢加入吲哚試劑10～15 滴。如有吲哚存在，在試劑和培養(yǎng)基界面層呈現(xiàn)玫瑰紅色判為陽性。

1.2.4.4 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)。在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上劃單線接種被檢細(xì)菌，37℃培養(yǎng)48～72h。陽性者斜面有細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基變藍(lán)色判為陽性。

1.2.4.5 藥物敏感性檢測(cè)。在已做過生化鑒定的大腸桿菌中，按不同牛場(chǎng)和不同乳區(qū)分別選取32株大腸桿菌作為藥物敏感性檢測(cè)的菌株。將待測(cè)菌株接種于普通肉湯培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，取培養(yǎng)液5mL 加入到帶刻度的離心管中，2 000 r/mim 離心20min，棄去上清，在離心管中加與沉淀物等量的生理鹽水混勻，用細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法，確定出cfu（每毫升培養(yǎng)液中細(xì)菌的數(shù)量）；用滅菌生理鹽水將培養(yǎng)物稀釋至1×109cfu。用滅菌棉拭子醮取菌液，均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，用無菌鑷子將藥敏紙片均勻等距離平貼于培養(yǎng)板，每個(gè)平板上6 片。置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，18h 后測(cè)量不同藥敏片抑菌環(huán)直徑，按照藥敏紙片說明進(jìn)行細(xì)菌藥物敏感程度判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 隱性乳房炎檢測(cè)及其奶樣中大腸桿菌分離率

在廣東省梅州市5個(gè)奶牛場(chǎng)的518份有效奶樣中，隱性乳房炎陽性率和大腸桿菌分離率有差異，見表3。

表3 隱性乳房炎檢測(cè)結(jié)果及奶樣中大腸桿菌分離率 %

由表3可知，隱性乳房炎平均頭陽性率和乳區(qū)陽性率分別為56.94%和28.30%；大腸桿菌的平均頭分離率和乳區(qū)分離率分別為29.83%和10.92%。將這幾個(gè)月的奶樣相比較，可得出，隨氣溫的逐漸升高大腸桿菌所引起的隱性乳房炎在隱性乳房炎中所占比例逐漸升高，但是隱性乳房炎的檢測(cè)陽性率則無明顯變化。

2.2 分離菌株生化鑒定結(jié)果

在518份奶樣中共分離出疑似大腸桿菌188株，對(duì)其中86株進(jìn)行了5 項(xiàng)生化反應(yīng)的測(cè)定，完全符合埃希氏大腸桿菌生化特性的菌株50株，占被鑒定菌株的58.14%，鑒定菌株5 項(xiàng)生化反應(yīng)結(jié)果見表4。

表4 生化鑒定結(jié)果

2.3 奶中大腸桿菌對(duì)藥物的敏感性

隨機(jī)挑取完全符合大腸桿菌生化特性的32株菌進(jìn)行臨床常用治療藥物的敏感性檢測(cè)，這些菌株對(duì)不同藥物的敏感性見表5。

表5 大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 %

由表5可知，所有菌株對(duì)頭孢噻呋、多粘菌素和阿米卡星都高度敏感；部分菌株對(duì)多西環(huán)素、氧氟沙星和環(huán)丙沙星有一定耐藥性；大部分菌株對(duì)阿莫西林、氨芐青霉素、鏈霉素和復(fù)方新諾明有很強(qiáng)的耐藥性。

2.4 不同牛場(chǎng)奶樣中大腸桿菌的藥物敏感性

挑取完全符合大腸桿菌生化特性的不同牛場(chǎng)的3 2株菌進(jìn)行臨床常用治療藥物的敏感性檢測(cè)，判定不同牛場(chǎng)的大腸桿菌藥物敏感性見表6。

表6 不同牛場(chǎng)大腸桿菌的藥物敏感性 %

由表6可知，盡管所有菌株對(duì)頭孢噻呋、多粘菌素和阿米卡星的敏感度高，但是不同牛場(chǎng)菌株對(duì)不同藥物的敏感性不同：牛場(chǎng)2 對(duì)頭孢噻呋中度敏感；牛場(chǎng)4 對(duì)多粘菌素中度敏感，但是對(duì)氧氟沙星敏感；牛場(chǎng)3 除對(duì)頭孢噻呋、多粘菌素和阿米卡星敏感外，還對(duì)環(huán)丙沙星敏感；且復(fù)方新諾明在牛場(chǎng)2、牛場(chǎng)3、牛場(chǎng)4、牛場(chǎng)5 都耐藥，但在牛場(chǎng)1 中度敏感。

3 小結(jié)

3.1 通過對(duì)廣東省梅州市5個(gè)奶牛場(chǎng)250頭奶牛

的奶樣進(jìn)行隱性乳房炎檢測(cè)和大腸桿菌分離鑒定，結(jié)果表明，奶牛隱性乳房炎平均頭陽性率和乳區(qū)陽性率分別為56.94%和28.30%，大腸桿菌頭陽性率和乳區(qū)陽性率為29.83%和10.92%。

3.2 不同牛場(chǎng)分離的大腸桿菌藥物敏感性基本相同，均對(duì)頭孢噻呋、多粘菌素和阿米卡星敏感，85.60%的菌株對(duì)多西環(huán)素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感。

3.3 奶牛隱性乳房炎陽性率不隨季節(jié)呈規(guī)律性變化，但大腸桿菌的分離率則有明顯的季節(jié)性變化。

[1]王桂琴，吳聰明，陳霞，等.奶牛乳房炎大腸桿菌的血清型及耐藥性調(diào)查研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2006，26（3）：223～228.

[2]王成，董潔，高東，等.奶牛隱性乳房炎的檢測(cè)與治療效果觀察[J].畜牧與獸醫(yī)，1998，30（3）：123～124.

[3]周慶國(guó)，黎杰虹，陳晉城，等.佛山地區(qū)奶牛臨床型乳房炎發(fā)病情況調(diào)查及原分離與鑒定[J].中國(guó)奶牛，2002，(3)：33～34.

[4]馬保臣，李建基，劉錫武，等.奶牛急性乳房炎病原菌的分離與鑒定研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2003，(1)：35～36.

[5]徐志光，王治才，楊學(xué)云，等.新疆部分地區(qū)奶牛隱性乳房炎大腸桿菌的初步研究[J].草食家畜，2006，（2）：58～59.

[6]李新圃，郁杰，李宏勝，等.個(gè)體奶牛場(chǎng)乳牛乳腺炎主要病原菌及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2001，31（11）：41～43.

[7]張中文，吳國(guó)娟，劉鳳華，等.北京地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，17（4）：42～47.