陳錫強(qiáng)，彭維兵，侯海榮，王希敏，劉可春，韓利文，袁延強(qiáng)

(山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250014)

中草藥的抗腫瘤作用通過藥理實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)得到證實(shí)［1-2］，其作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管形成和提高機(jī)體免疫等方面。近年來，抑制血管生成已經(jīng)成為抗腫瘤的一種新療法，但是，在中藥材中進(jìn)行系統(tǒng)性抑制血管生成的研究還鮮有報(bào)道，我們利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型對多種傳統(tǒng)中藥材提取物進(jìn)行活性篩選，以期獲得有價值的中藥提取物。

斑馬魚是近年來公認(rèn)的最適合用于抑制血管生成和血液病藥物篩選的模式動物。在斑馬魚早期發(fā)育的過程中胚胎透明，可直接觀察到各組織器官。由于斑馬魚血管生成的方式比較簡單，在顯微鏡下就能夠觀察到節(jié)間血管、血流和紅細(xì)胞的形態(tài)，因而被用于血管形成方面和血液類疾病藥物篩選。血管熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以清晰地進(jìn)行斑馬魚節(jié)間血管的計(jì)數(shù)［3］，方便地考察藥物的抑制血管生成作用。本實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚測定了27 種中藥材提取物的抑制血管生成活性，并采用雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)對發(fā)現(xiàn)的部分活性提取物進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料:

1.1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚

Tg(VEGFR2:GFP)系，本實(shí)驗(yàn)室繁殖。7 d 雞胚蛋由濟(jì)南滋平家禽養(yǎng)殖有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品與試劑

實(shí)驗(yàn)用中藥材均購自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)鑒定后使用。實(shí)驗(yàn)用有機(jī)溶劑均為分析純。27 種中藥材各500 g，提取過程:藥材經(jīng)過粉碎后，用石油醚回流提取3 次，提取液過濾后濃縮干燥即得到石油醚部位;藥渣揮去溶劑，再用乙酸乙酯1:5 回流提取3 次，提取溶液過濾后濃縮干燥得到乙酸乙酯部位;再用蒸餾水回流提取3 次，水液濃縮干燥后得到水溶液提取物。陽性對照PTK787 (Sigma 出品，純度＞96%)用二甲基亞砜溶解，用水稀釋成終濃度100 μg·mL-1的溶液(二甲基亞砜終濃度為0.1%)，置冰箱中備用。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

OLYMPUS SZX16 體視熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);COIC 倒置熒光生物顯微鏡XDS-1B(重慶光學(xué)儀器廠);LRH-250-G 光照培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠)。

2 斑馬魚血管生成抑制實(shí)驗(yàn)

斑馬魚的養(yǎng)殖和培育參照Westerfield 的方法［4］。選擇成熟斑馬魚雌雄一對，傍晚時放入培育缸中，第二天早上產(chǎn)卵后取出受精卵置新鮮培養(yǎng)水中，28℃光照培養(yǎng)箱備用。

魚胚胎于受精24 h(hours of post fertilization，hpf)后取出，置于1 μg·mL-1鏈霉蛋白酶溶液中脫去卵膜，將脫膜胚胎加入96 孔板中，每孔一只;將石油醚部位、乙酸乙酯部位和水提物分別加入96 孔板中，每種提取物各8 個胚胎;對照組8 個胚胎，加培養(yǎng)水，其中二甲基亞砜的體積分?jǐn)?shù)為0.1%，不加入任何藥物;PTK787 為陽性藥物組，終濃度為10 μg·mL-1。加藥后將96 孔板放入光照培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，

加藥24 h 后，加入體積分?jǐn)?shù)為1‰三卡因溶液麻醉魚體，在熒光顯微鏡下觀察記錄斑馬魚血管熒光表達(dá)強(qiáng)弱狀況，并對體節(jié)間血管(ISV)計(jì)數(shù)。

血管抑制率的計(jì)算:

3 雞胚尿囊膜血管生成實(shí)驗(yàn)

選擇7 d 齡活胚蛋，隨機(jī)分組，每組15 個，在照卵燈下尋找胚頭中軸側(cè)區(qū)域，劃定1 cm×1 cm 圓形開窗部位，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液消毒開窗部位，在雞胚氣室端鉆2 mm 小孔并穿透殼膜。暴露出雞胚尿囊膜，用微量進(jìn)樣器將各組藥物滴加入甲基纖維素濾膜中，將濾膜放置于尿囊膜上血管部位，給藥方式為:對照組為每個雞胚生理鹽水20 μL，4 組中藥提取物組為各提取物100 μg/個，加藥完畢后用膠帶密實(shí)封口。并繼續(xù)放入37 °C 的孵箱內(nèi)孵育72 h。

新生血管數(shù)量計(jì)算:揭開透明膠帶，加滿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛，室溫下原位固定30 min。待CAM 上血管內(nèi)的血液凝固后，揭去封窗的透明膜，剪除CAM 以上的蛋殼，以濾膜載體為中心把CAM剪下，投入水中，使其舒展開，并將其在水中轉(zhuǎn)移到載玻片上，自然干燥。拍照后用Photoshop 選定照片上的一定面積(800 ×800 像素)，計(jì)算3 個面積內(nèi)的平均血管數(shù)目并計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

統(tǒng)計(jì)方法:各組指標(biāo)均以ˉX ±SD表示，使用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，多個樣本均數(shù)采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

表1.中藥材提取物抑制血管生成活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of anti-angiogenic activity of Chinese herbal extracts on zebrafish

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

4.1 中藥材提取物對班馬魚血管生成的抑制作用

熒光顯微鏡下拍攝的實(shí)驗(yàn)照片可見，對照組節(jié)間血管生成的綠色熒光顯示血管完整、清晰，平均值在26～30 條之間。陽性對照組在PTK787 作用了24 h 后，綠色熒光消失。節(jié)間血管完全消失，乳香水提取物組節(jié)間血管有明顯缺失，變細(xì)，熒光變?nèi)醯茸兓?，見?、圖1。

4.2 中藥材提取物對雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用

提取物處理雞胚72 h 后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組微孔濾膜周圍CAM 血管生長良好，呈樹枝狀、葉脈樣、平行生長;藥物組血管變細(xì)、側(cè)枝減少、藥物濾膜近端血管密度減少等。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各組均顯示出血管生成減少現(xiàn)象，鬼箭羽乙酸乙酯組與乳香水組均出現(xiàn)平均值顯著性減少見表2、圖2。

圖1 中藥材提取物對斑馬魚胚胎ISV 生成的影響(ISV 如箭頭所示，熒光顯微鏡下×250)Fig.1 Impact of Chinese herbal extract on the ISV of zebrafish(×250).

表2 中藥材提取物對雞胚尿囊膜血管生成的影響Table 2 Impact of antiangiogenic activity of Chinese herbal extracts on CAM

圖2 多種中藥材對雞胚尿囊膜血管生成的作用(×250)Fig.2 Impact of multiple Chinese herbal extracts on the ISV of zebrafish (×250).

5 討論

斑馬魚作為模式生物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于胚胎發(fā)育以及藥物篩選研究中，目前已經(jīng)建立多種靶點(diǎn)疾病模型，如阿爾海默茲病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、白血病、血栓病、糖尿病與腫瘤等［5］，斑馬魚血管生成模型是抗腫瘤血管生成藥物篩選的新模型，此模型被認(rèn)為同時具有高通量和活體實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)。VEGF 是迄今發(fā)現(xiàn)最有效的一類促血管生成因子，研究比較清楚的受體2 主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，對血管生成起重要作用［6］，因而VEGFR-2 是抑制血管生成藥物主要的作用靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用VEGFR-2 與綠色熒光蛋白共表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，可以在整體實(shí)驗(yàn)中觀察藥物對血管生成的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較多的中藥材提取物具有抑制血管生成的作用或者傾向，而27 種藥材的提取物活性出現(xiàn)一些規(guī)律:有活性的部位主要集中在水提物和乙酸乙酯提取物中，石油醚部分或許是受到極性影響和水溶性的影響，幾乎沒有明顯的抑制活性結(jié)果出現(xiàn)，抑制率強(qiáng)度基本符合:水提物＞乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物的規(guī)律。大青葉的活性跟蹤研究結(jié)果顯示，靛玉紅為大青葉抑制活性的主要化合物［7］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其提取物的抑制率為17.5%。文獻(xiàn)報(bào)道鬼箭羽的提取物對于基質(zhì)金屬蛋白MMP-9 的活性有明顯抑制作用［9］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鬼箭羽提取物具有抑制血管生成活性，提示其具有抑制血管生成的作用，與文獻(xiàn)結(jié)果相符。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，乳香中主要成分11-羰基-乙?；橄闼嵊锌寡苌捎煤驼T導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［11］，乳香酸能通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2 介導(dǎo)的血管新生作用而起到抗腫瘤細(xì)胞的作用［12］，也有研究指出，乳香酸能通過抑制IKK 活化抑制核因子NF-κB 的活性，下調(diào)受NF-κB 調(diào)控的基因，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［13］，在本實(shí)驗(yàn)中，乳香水提取物抑制率最高達(dá)到了17.6%。從發(fā)現(xiàn)新活性成分的角度來看，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行天然產(chǎn)物的篩選為高效實(shí)驗(yàn)方法，主要成分具有抑制血管生成活性的中藥材均可在粗提物中有明顯的體現(xiàn)，并能闡釋其對VEGFR 的作用。

本課題前期的研究結(jié)果表明，無論是中藥粗提物還是中藥復(fù)方，若采用合理的提取方法和配伍得當(dāng)，都能夠抑制斑馬魚節(jié)間血管的生長［14］，顯示出抑制血管生成和抗腫瘤作用。利用斑馬魚模型可以快速評價中藥材粗提物對VEGF 受體表達(dá)的影響，為提升中藥材靶點(diǎn)藥物的發(fā)現(xiàn)提供了新的研究思路，也成為揭示中藥材抗腫瘤作用機(jī)理的新研究工具。轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型為發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化合物提供了有效的活性評價手段，也為抗癌中藥復(fù)方的配伍科學(xué)性提供有效依據(jù)，因而對中藥現(xiàn)代化發(fā)展具有重要的意義。

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