張 憲，雷天宇，金殿川

(河北聯(lián)合大學(xué)理學(xué)院，河北唐山 063009)

0 引言

在真核生物中普遍存在著古老的四倍體性，基因組倍增之后會形成大量的直系或旁系的同源基因。在進化過程中，倍增的同源基因中的一個拷貝會趨向于丟失，但這種基因丟失是不平衡的［1］。多個研究表明，蜀黍族祖先基因組是由10個染色體組成。玉米作為重要的糧食作物，曾在500～1200萬年前，經(jīng)歷了一次四倍化，形成了20條染色體。玉米通過染色體融合、斷裂等過程，形成現(xiàn)在的10條染色體，以兩個亞基因組的形式存在［2-3］。值得注意的是，在四倍化后，由于純化選擇其中一個亞基因基因不斷被移除，而相對的另一個亞基因組基因則更可能保持中立，從而更多的保留了下來。

玉米不僅是重要的糧食作物，同時也是重要的C4光合作用作物。C4光合途徑是許多高產(chǎn)農(nóng)作物的代謝途徑方法，相對于C3植物來說，其更能高效的利用光能、水以及氮。2009年，Wang［4］等通過比較基因組學(xué)分析，證實了全基因組以及單個基因的倍增有利于C4光合作用的進化。因此，玉米在由古老的四倍體到二倍體的進化過程中，C4光合作用必然也經(jīng)歷了相應(yīng)的進化過程。

在蜀黍族的進化過程中，高粱基因組被推測近似保留了祖先基因組。2011年，James C.S［1］等人通過對玉米和高粱進行全基因組的同源序列比對，重構(gòu)了染色體水平上的玉米四倍體祖先，定義了兩個亞基因組。本文旨在對玉米中兩個亞基因組與C4途徑的進化進行研究，進一步回答兩個亞基因組基因在C4途徑的進化過程中扮演什么樣的角色。這將有利于我們更深入的了解玉米兩個亞基因基因的進化遺傳機制，以及其對C4光合作用的影響，對我們進一步提高玉米光合作用強度，從而為提高玉米產(chǎn)量提供重要的理論基礎(chǔ)和材料來源。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)準備

本研究中玉米兩個亞基因組的相關(guān)數(shù)據(jù)來自于James C.S［1］等人在重構(gòu)玉米染色體后，通過和高粱、水稻的同源序列比對，構(gòu)建了一個Excel格式記錄，主要由Maize1、Maize2以及在高粱和水稻中相應(yīng)的同源基因組成。玉米中與C4光合作用途徑有關(guān)的基因、酶以及反應(yīng)數(shù)據(jù)，從GRAMENE(http://pathway.gramene.org/MAIZE/)數(shù)據(jù)庫下載得到。

1.2 進化分析的方法概述

分子進化完整的理論分析過程主要包括四個重要的步驟，即序列相似性比較、序列同源性分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、穩(wěn)定性檢驗。

BLAST［5］(Basic Local Alignment Search Tool)是最常用的序列相似性比較的工具，其基本思想是:兩個同源序列即使有很大的差異，也有可能有高分值的相似片段，這使我們能夠可靠地區(qū)分相關(guān)和非相關(guān)的序列。同源序列的進化相關(guān)性可以用相似度來表示［5］，而最佳的比對算法就是要使比較序列的相似度最大化。

根據(jù)相似序列的同源性分析，重建反映物種間進化關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法很多種。根據(jù)所處理數(shù)據(jù)的類型，可以將系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建方法大體上分為兩大類。一類是基于距離的構(gòu)建方法，利用所有物種或分類單元間的進化距離，依據(jù)一定的原則及算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。這類方法包括非加權(quán)組平均法(unweighted-pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)、近鄰關(guān)系法、鄰近歸并法(neighbor-joining method)等。其中廣泛應(yīng)用的就是鄰近歸并法，它由一個中心節(jié)點，通過尋找最小進化樹的分支長度和，相繼找到相鄰分支。1998年，J.Studier和 K.Keppler提出了一種快速算法［6］:

其中，N是距離矩陣中物種的數(shù)目，k是引入的外部參考物種，dij是物種i和物種j之間的距離。

另一類方法是基于離散特征的構(gòu)建方法，利用的是具有離散特征狀態(tài)的數(shù)據(jù)，如DNA序列中的特定位點的核苷酸。屬于這一類的方法有簡約法(parsimony method)，主要包括無權(quán)簡約法和加權(quán)簡約法、最大似然法(maximum likelihood approach)等。

構(gòu)建好的進化樹需要進行統(tǒng)計上的可靠性檢驗，常用的檢驗方法是Bootstap算法，其隨機進行成百上千次序列重排，對這些新的序列進行建樹，再觀察這些樹與原始樹是否有差異，以此評價建樹的可靠性，一般只有以大概率(70%以上)出現(xiàn)的分支點才是可靠地。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米C4途徑關(guān)鍵酶基因及其同源性分析

GRAMENE數(shù)據(jù)庫分物種、分通路、分條目記錄了基因、酶、代謝物、反應(yīng)甚至通路數(shù)據(jù)。在玉米(Zea mays)C4光合途徑通路下，一共獲得15個與C4途徑相關(guān)的基因(表1)，它們不均勻的分布在染色體中。C4光合途徑牽涉許多酶類的參與，其中最為關(guān)鍵的酶有3個，分別為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)和NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)，它們的編碼基因就有14個［7］，剩余的一個是葉綠體蛋白質(zhì)。

高粱和玉米具有一個共同的祖先，在高粱的進化過程中近似保留了祖先基因組，將玉米C4基因與高粱基因組應(yīng)用現(xiàn)有的生物信息分析程序BLASTN進行同源序列比對分析，得到玉米C4基因與高粱基因間的相似性，根據(jù)序列間的打分、序列一致性、匹配期望值，確定基因間的同源性，這里設(shè)定期望值小于1e-3。表1中第一列是要查詢的玉米C4相關(guān)基因，對于一個基因序列在目標數(shù)據(jù)庫中有多個基因序列與它匹配，匹配的百分比是兩個比對的基因序列中匹配的長度占比對上長度的百分比，比對的基因序列的長度是兩個基因序列的保守域的長度，而期望值的大小反映了兩個基因存在進化關(guān)系的隨機性可能性大小，期望值越小說明兩個基因越有可能具有進化關(guān)系，匹配打分則反映了兩個基因序列間的相似程度。

表1 玉米C4基因與高粱潛在同源基因集合表

續(xù)表1

這里我們選取了匹配得分最高的基因，即相似性最高的高粱基因作為玉米C4基因的相似性基因。由表1可以看到，C4途徑相關(guān)基因中玉米和高粱保持了高度的相似性，相似性均達到90%以上，且期望值比較小，進一步說明了玉米和高粱C4基因間具有進化關(guān)系。

2.2 玉米C4途徑基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析

利用MEGA軟件對玉米和高粱中C4途徑相關(guān)的同源基因做CLUSTAL多序列比對，然后采用鄰近歸并法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并對得到的系統(tǒng)發(fā)育樹進行自舉檢驗，將自舉檢驗的值設(shè)置為500，構(gòu)建的結(jié)構(gòu)及分析如圖1所示。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看到，玉米C4途徑的三個關(guān)鍵酶基因分別形成了一個小的基因家族，這三個小的家族分別形成各自的分支，其中PPDK基因由兩個分支組成，它們分別編碼葉綠體PPDK1和細胞質(zhì)PPDK2基因，其經(jīng)歷了不同的自適應(yīng)進化過程。從整體上來看，這三個家族在C4途徑中分別進行了一個快速的進化，且很可能屬于自適應(yīng)選擇進化過程。同時C4途徑中單一存在的葉綠體蛋白酶基因NADP-MDH基因，也有自己獨立的適應(yīng)進化過程。

圖1 玉米和高粱中C4途徑中同源基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖1中還可以發(fā)現(xiàn)，高粱基因與玉米基因進化速率一定程度上保持了一致性，且在幾個分支上，一個高粱基因同時和兩個玉米基因的進化保持一致，證實了玉米中兩個亞基因組的存在。另外，根據(jù)James C.S［1］等人對玉米兩個亞基因組的定義，分別命名為Maize1和Maize2。玉米PEPC基因家族中，Maize1包括4個，分別是 GRMZM2G083841/pep1、GRMZM2G473001/pep4、GRMZM2G069542、GRMZM2G082780;Maize2 包括2個，分別是GRMZM2G110714、GRMZM2G074122。PPDK基因家族中，Maize1包括3個，分別是 pdk2/AC217975.3_FG001、GRMZM2G306345_P05、pdk1/GRMZM2G097821;Maize2 包括 1 個，即 GRMZM2G097457_P01。對于NADP-ME基因家族，在玉米基因和高粱基因相似性分析中，由于其同義替換率(Ks)值比較大，無法準確判斷其所屬亞基因組，只能由其相應(yīng)的物理位置大致判斷出，Maize1包括 2個，分別為GRMZM5G886257_P01、me3/GRMZM2G085019;Maize2包括 2個，分別為 GRMZM2G404237_P01、me2/GRMZM2G122479。NADP-MDH基因GRMZM2G129513定義為Maize1。從總體上來看，在C4途徑有關(guān)基因中，Maize1占到總基因的2/3，Maize2占到了1/3，這說明兩個亞基因組中同源基因在進化過程中丟失不均衡，Maize1相對于Maize2保留了更多的基因，其對C4途徑的進化具有更大的貢獻。

3 結(jié)論

玉米作為C4光合作用的重要模式作物，對其C4途徑進化過程的研究，為進一步提高光合作用效率，進而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，具有十分重要的作用。本文通過對玉米中有關(guān)C4途徑的基因與高粱基因進行比較分析，并構(gòu)建了相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)了C4途徑中3個關(guān)鍵酶的基因家族以及一個葉綠體蛋白質(zhì)基因，其都具有獨立的適應(yīng)進化過程。同時，對于玉米C4途徑中兩個亞基因組基因的存在，給出了明確的定義。在C4光合作用途徑中，玉米兩個亞基因組基因存在明顯的偏向性，即亞基因組Maize1相對于Maize2保留了更多的基因。本文僅對玉米中C4途徑中兩個亞基因組的存在進行了研究，而兩個亞基因組對于玉米其它途徑的影響，還不能給出明確的說明，如果進一步對玉米中其他代謝途徑進行研究，能否得到更具生物學(xué)意義的結(jié)論，這將是今后進一步研究的問題。

［1］JamesC.Schnable，Nathan M.Springer，Michael Freeling.Differentiation of the maize subgenomes by genome dominance and both ancient and ongoing gene loss［J］.PNAS，2011，108(10):4069-4074.

［2］Wei F，William Nelson，Ed Coe，et al.Physical and genetic structure of the maize genome reflects its complex evolutionary history.PLoS Genet，2007，3(7):e123.

［3］Salse J，Bolot S，Throude M，et al.Identification and characterization of shared duplications between rice and wheat provide new insight into grass genome evolution ［J］.Plant Cell，2008，20(1):11-24.

［4］Wang X.Y，Haibao Tang，et al.Comparative genomic analysis of C4 photosynthetic pathway evolution in grasses［J］.Genome Biology，2009，10:R68.

［5］C.薩科內(nèi)，G.佩索萊.比較基因組學(xué)手冊—原理與方法［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008:185-198.

［6］Studier，J.A.andK.J.Keppler.A note on the neighbor-joining algorithm of Saitou and Nei［J］.Mol Biol Evol.1988，5(6):729-731.

［7］李艷.玉米C4途徑關(guān)鍵酶(PEPC、PPDK)基因的克隆及PEPC基因?qū)π←湹倪z傳轉(zhuǎn)化［D］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué).2009:4-10.