王晶，東星，楊彩霞，王心，尚麗新

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病，是導致孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因之一[1]，目前其發(fā)病機制尚未完全闡明。肝X受體(LXRs)作為一種氧化型固醇激活的核受體，參與機體多種生理活動的調(diào)節(jié)，包括膽固醇代謝﹑脂肪代謝﹑糖代謝和炎癥過程等[2-4]。Endoglin與滋養(yǎng)細胞的浸潤功能密切相關(guān)。本研究采用Real-time PCR檢測妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中LXRα與Endoglin mRNA的相對表達量，從基因水平探討二者與妊娠期高血壓疾病發(fā)病的關(guān)系，以期為該病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2010年8月－2011年4月在北京軍區(qū)總醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的妊娠期高血壓疾病患者44例作為妊娠高血壓疾病組，年齡29.5±3.2歲，孕齡262.1±13.9d。其中妊娠期高血壓患者15例，輕度子癇前期患者14例，重度子癇前期患者15例。妊娠期高血壓疾病的診斷標準參照樂杰主編的《婦產(chǎn)科學(第7版)》[1]。選取同期正常晚期妊娠婦女16例作為對照組，年齡28.6±3.9歲，孕齡264.3±14.6d。兩組孕婦均為單胎，孕前無原發(fā)性高血壓﹑糖尿病﹑慢性腎炎﹑甲狀腺功能亢進癥﹑肝炎及結(jié)核等急慢性病史，無煙酒等不良嗜好。兩組孕婦均自愿參加本試驗并簽署知情同意書。兩組孕婦年齡﹑孕齡﹑孕次及分娩方式之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 胎盤娩出后，立即剪取臍帶對側(cè)胎盤組織約300mg，剪成約1cm×1cm×1cm大小，裝入凍存管中，投入液氮過夜后轉(zhuǎn)入－80℃低溫冰箱保存，以備RNA提取。

1.2.2 胎盤組織LXRα及Endoglin mRNA表達檢測

1.2.2.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 按照大連寶生物工程有限公司Trizol總RNA提取試劑說明提取RNA。用紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測所獲RNA的完整性﹑純度和含量。RNA置－80℃保存?zhèn)溆?。按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄：30℃ 5min，42℃ 60min，99℃ 5min，5℃ 5min。反應體系為20μl。

1.2.2.2 Real-time PCR LXRα上游引物5'-TGGAGACATCTCGGAGGTAC-3'，下游引物5'-GCAATGAG CAAGGCAAACT-3'；Endoglin上游引物5'-TAGCCCT GCGTCCCAAGA-3'，下游引物5'-CGATGAGGAAGG CACCAAA-3'。采用SYBR Green熒光染料法進行Real-time PCR擴增。反應體系為20μl，包括1×Real Master Mix，1×SYBR Green，上﹑下游引物各1μl(5pmol)及1μl模板。以GAPDH作為內(nèi)參照。反應條件為：94℃預變性5min；94℃ 30s﹑52℃ 30s﹑72℃ 40s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增后獲得各組Ct值，繪制標準曲線。用基于ΔΔCt的方法進行相對定量分析，基因表達差異為–2ΔΔCt。ΔΔCt=ΔCt樣品－ΔCt內(nèi)參考。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 胎盤組織中LXRα及Endoglin的熔解曲線 胎盤組織中LXRα及Endoglin熔解曲線見圖1，橫坐標為溫度，縱坐標為熒光強度，結(jié)果顯示二者均有單一的產(chǎn)物峰。

圖1 LXRα及Endoglin的熔解曲線Fig.1 Melting curve of LXRα (A) and Endoglin (B)

2.2 Real-time PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，LXRα及Endoglin在正常孕婦﹑妊娠期高血壓疾病患者和陽性對照組均出現(xiàn)與預期大小一致的片段，陰性對照沒有出現(xiàn)任何條帶(圖2)。

2.3 胎盤組織中LXRα及Endoglin mRNA的表達單因素方差分析顯示，妊娠期高血壓疾病組孕婦胎盤組織中LXRα及Endoglin mRNA相對表達量與對照組比較明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。進一步兩兩比較顯示，重度子癇前期組﹑輕度子癇前期組LXRα及Endoglin mRNA相對表達量明顯高于對照組，且重度子癇前期組明顯高于輕度子癇前期組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而妊娠期高血壓組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖3)。

圖2 各組胎盤組織中LXRα及Endoglin的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 PCR products of LXRα and Endoglin in placenta from four groups (Gel electrophoresis)

圖3 各組胎盤組織中LXRα及Endoglin mRNA的相對表達量Fig.3 Relative expression of LXRα and Endoglin mRNA in placenta tissue of four groups

3 討 論

3.1 LXRα與妊娠期高血壓疾病 LXRs是孤兒核受體家族成員，研究證實其與胎盤組織中脂肪酸的轉(zhuǎn)運和代謝有密切關(guān)系，并可抑制胎盤滋養(yǎng)細胞分泌HCG，在人類胎盤中發(fā)揮重要作用[5]。

Plosch等[6]研究發(fā)現(xiàn)LXRα及其目標基因ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1(ABCA1)在人類胎盤組織中呈高表達，其表達水平受低氧的調(diào)節(jié)，該調(diào)節(jié)機制失衡是導致子癇前期患者胎盤缺血的原因之一。本研究結(jié)果顯示，妊娠期高血壓疾病組胎盤組織LXRα mRNA表達明顯高于對照組，其中輕度子癇前期組明顯高于對照組，重度子癇前期組明顯高于輕度子癇前期組，推測LXRα表達水平升高與子癇前期的發(fā)病及病情進展有關(guān)。LXRα能增加血漿甘油三酯(TG)生成[7]，是動脈粥樣硬化發(fā)生的獨立危險因素。子癇前期患者胎盤組織中LXRα高表達可能會導致子宮螺旋動脈發(fā)生粥樣硬化，使胎盤血流灌注減少，從而引發(fā)子癇前期的一系列癥狀。LXRα的激活劑可提高巨噬細胞腫瘤壞死因子(TNF)mRNA的表達水平，TNF誘導血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生前列腺素和內(nèi)皮素，導致血管收縮和血壓升高[8]。LXR特異性配體GW3965能夠劑量依賴性地抑制血管內(nèi)皮細胞EA.hy926中內(nèi)皮素1(ET-1)的mRNA和蛋白表達，并且抑制ET-1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，從而起到降壓的作用[9]。

3.2 Endoglin與妊娠期高血壓疾病 Endoglin基因位于人染色體9q34，是一種同型二聚體(TGF-β1和TGF-β3的復合受體)跨膜糖蛋白，主要表達于人類內(nèi)皮細胞表面和足月胎盤合體滋養(yǎng)層細胞表面。研究發(fā)現(xiàn)，在胎盤及胎盤血管快速發(fā)育期，Endoglin表達增強，但持續(xù)維持在低水平，這有利于正常胎盤的形成和胚胎的發(fā)育。

本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期高血壓疾病組胎盤組織中Endoglin mRNA表達量明顯高于對照組，且輕﹑重度子癇前期組均明顯高于對照組，提示胎盤組織中Endoglin水平與妊娠期高血壓疾病的發(fā)病及病情發(fā)展有關(guān)，與Gu等[10]的研究結(jié)果一致。有研究證實，缺氧可以誘導孕鼠胎盤及循環(huán)中Endoglin表達增加，且增高的Endoglin與孕鼠高血壓密切相關(guān)[11]，而胎盤組織中Endoglin表達上調(diào)可抑制TGF-β調(diào)控的促細胞凋亡作用，影響胎盤血管發(fā)育和重塑[12]，從而影響滋養(yǎng)細胞的浸潤功能，引起胎盤淺著床，參與妊娠期高血壓疾病的發(fā)病。Endoglin與TGF-β1結(jié)合，通過不同途徑使一氧化氮(NO)生成減少，導致血管收縮，外周血管阻力增加，血壓升高[13]。此外，Endoglin可抑制滋養(yǎng)細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的表達，從而使滋養(yǎng)細胞降解細胞外基質(zhì)的能力減低，侵襲能力下降，引起妊娠高血壓疾病的一系列癥狀[14]。

3.3 LXRα及Endoglin的相關(guān)性研究 Henry-Berger等[15]研究發(fā)現(xiàn)，LXRα可上調(diào)胎盤組織中Endoglin的表達，繼而阻斷TGF-β/Endoglin信號途徑，導致血管內(nèi)皮細胞屏障受損，引起細胞水腫及蛋白尿。

總之，本研究結(jié)果顯示胎盤組織中LXRα及Endoglin mRNA表達水平增高與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，但其參與子癇前期病理生理過程的具體機制還需進一步探討。檢測并調(diào)控胎盤組織中LXRα及Endoglin的表達水平對于防治妊娠期高血壓疾病可能具有一定的臨床意義。

[1] Le J. Obstetrics and gynecology[M]. 7th ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2008. 92-99. [樂杰. 婦產(chǎn)科學[M]. 7版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2008. 92-99.]

[2] Qi YJ, Xu MJ, Yu Q. The expression and meaning of liver X receptor in obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome patients[J]. Chin J Pract Inter Med, 2009, 29(7): 632-634. [亓永杰, 胥美娟, 余勤. 肝X受體在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的表達及意義[J]. 中國實用內(nèi)科雜志, 2009, 29(7):632-634.]

[3] Geyeregger R, Zeyda M, Stulnig TM. Liver X receptors in cardiovascular and metabolic disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2006,63(5): 524-539.

[4] Zhu J, Wang SL. Liver X receptors and glycolipid metabolism disorder[J]. Acta Acad Med CPAPF, 2009, 18(7): 654-657. [朱靜, 王素莉. 肝X受體與糖脂代謝紊亂[J]. 武警醫(yī)學院學報,2009, 18(7): 654-657.]

[5] Weedon-Fekjaer MS, Dalen KT, Sollas K, et al. Activation of LXR increases acyl-CoA synthetase activity through direct regulation of ACSL3 in human placentaltrophoblast cells[J]. J Lipid Res,2010, 51(7): 1886-1896.

[6] Plosch T, Gellhaus A, Vanstraten EM, et al. The liver X receptor(LXR) and its target gene ABCA1 are regulated upon low oxygen in human trophoblast cells: a reason for alterations in preeclampsia[J]? Placenta, 2010, 31(10): 910-918.

[7] Chen J, Zheng RD, Xu CR, et al. Expression and significance of liver X receptor-alpha in nonalcoholic fatty liver disease in rats[J]. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi,2009, 23(4): 265-268.

[8] Landis MS,Patel HV, Capone JP. Oxysterol activations of liver X receptor and 9-cis-retinoic acid promote sequential steps in the synthesis and secretion of tumor necrosis factor-α from human monocytes[J]. J Biol Chem, 2002, 277(7): 4713-4721.

[9] Gao M, Su DM, Chao F, et al. Regulation of endothelin-1 expression of by liver X receptor in vascular endothelial EA.hy926 Cells[J]. J Med Mol Biol, 2008, 5 (6): 480-483. [高敏, 蘇冬梅, 晁帆, 等. 肝X受體對血管內(nèi)皮細胞EA.hy926內(nèi)皮素1表達的調(diào)節(jié)作用[J]. 醫(yī)學分子生物學雜志, 2008, 5(6):480-483.]

[10] Gu Y, Lewis DF, Wang Y. Placental productions and expressions of soluble endoglin, soluble fms-like tyrosine kinase receptor-1,and placental growth factor in normal and preeclamptic pregnancies[J]. J Clin Endocriol Metab, 2008, 93(1): 260-266.

[11] Gilbert JS, Gilbert SA, Arany M, et al. Hypertension produced by placental ischemia in pregnant rats is associated with increased soluble Endoglin expression[J]. Hypertension, 2009, 53(2):399-403.

[12] Levine RJ, Lam C, Qian C, et al. Soluble endoglin and other circulating antiangiogenic factors in preeclampsia[J]. N Engl J Med, 2006, 355(10): 922-1005.

[13] Sandrim VC, Palei AC, Metzger IF, et al. Nitricoxide formation is inversely related to serum levels of antiangiogenic factors soluble Fms-like tyrosine kinase-1 and soluble endoglin in preeclampsia[J]. Hypertension, 2008, 52(2): 402-407.

[14] Dong W, Xu QX, Han YH, et al. Inhibitory effects of soluble endoglin on invasive ability of cultured cytotrophoblasts of first trimester of pregnancy[J]. Acta Physiologica Sinica, 2011,63(3): 267-271. [董微, 許群星, 韓玉環(huán), 等. 可溶性endoglin減弱人早孕細胞滋養(yǎng)細胞的浸潤功能[J]. 生理學報, 2011,63(3): 267-271.]

[15] Henry-Berger J, Mouzat K, Baron S, et al. Endoglin (CD105)expression is regulated by the liver X receptor alpha (NR1H3) in human trophoblast cell line JAR[J]. Biol Reprod, 2008, 78(6):968-975.