王麗麗，陳達(dá)鑫，詹友知，蔡巧燕，莊群川，彭 軍

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122）

基于基質(zhì)輔助激光誘導(dǎo)解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption-ionization of flighttime mass spectrometry，MALDI-TOF）構(gòu)成的生物質(zhì)譜的組織成像技術(shù)（mALDI-imaging mass spectrometry，MALDI-IMS）是一門新興的分子成像技術(shù)。與其他成像技術(shù)相比，MALDI IMS技術(shù)不需要任何分離或純化的靶分子，不僅能夠監(jiān)測未知的分子，而且可對(duì)眾多分子的空間分布進(jìn)行定位。許多研究者證實(shí)，MALDI-IMS是一項(xiàng)發(fā)展極為迅速的研究方法［1］，可在大范圍的組織樣品中研究分子種類的分布［2］。MALDI IMS已用于直接探測薄組織切片中的蛋白質(zhì)、多肽、脂類和小分子類物質(zhì)的分布［3，4］，已廣泛用于疾病進(jìn)展和相關(guān)生物標(biāo)記物的探測［5-8］。本文利用MALDI-IMS技術(shù)對(duì)結(jié)腸癌組織切片進(jìn)行了分析，以探討相關(guān)蛋白的變化，為結(jié)腸癌相關(guān)的研究提供參考。

1 材 料

1.1 材料 導(dǎo)電載玻片（美國布魯克道爾頓公司）；結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫；SPF級(jí)裸鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 試劑 無水乙醇、MTT（西格瑪奧德里奇中國分公司）；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國賽默飛世爾公司）。

1.3 主要儀器 冷凍切片機(jī)（德國徠卡有限公司）；真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；掃描儀（臺(tái)灣Umax Co.）；ImagePrep、MALDI-TOF（美國布魯克道爾頓公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將市購人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29置于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）的RPM-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長，至80%～90%融合時(shí)以0.25%胰蛋白酶和EDTA消化傳代培養(yǎng)。1.5×106的細(xì)胞與基質(zhì)膠1∶1混合后于無菌條件下種植于裸鼠右側(cè)胸壁第二乳墊脂肪層下，觀察腫瘤的生長。待腫瘤中間壞死時(shí)，將裸鼠麻醉后取出腫瘤。

2.2 樣品的收集和保存 取下的腫瘤組織用PBS將血沖洗干凈，用錫箔紙將組織包好在-20℃冷凍30 min后，放于-80℃保存。

2.3 MALDI IMS腫瘤組織冷凍切片后轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電的載玻片上，切片用70%乙醇和100%乙醇浸洗。真空干燥后，利用ImagePrep工作站以均勻噴上芥子酸基質(zhì)（10mg/mL，乙腈∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.2）。

2.4 數(shù)據(jù)分析 采用FlexImaging 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集后，用ClinProTools 2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié) 果

新鮮的冷凍切片組織按照2.3進(jìn)行處理后，用掃描儀成像，結(jié)果見圖1A。實(shí)驗(yàn)中對(duì)整個(gè)組織切片進(jìn)行質(zhì)譜分析，并根據(jù)組織切片壞死的位置，選取腫瘤正常部位（ROI 1）與腫瘤壞死部位（ROI 2）進(jìn)行差異分析，見圖1。

ROI 1部分的平均質(zhì)譜圖和ROI 2部分的平均質(zhì)譜圖見圖2，從圖中可以看出：3348Da和6277Da的蛋白差異比較大。3348Da的蛋白在正常腫瘤組織中高于壞死部分；反之，6277Da的蛋白在腫瘤壞死部分高于正常部分。這2種差異蛋白在腫瘤切片組織中的分布見圖1B。

4 討 論

結(jié)腸癌（CRC）是世界上最常見的胃腸道腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全部惡性腫瘤中排第3位［9］。結(jié)腸癌5a生存率雖明顯增高，但確診時(shí)在伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，5a生存率僅有8%［10］。癌癥能否得到有效地治療及治愈取決于是否能夠在癌癥早期階段對(duì)其進(jìn)行及時(shí)地檢測。生物標(biāo)志物作為最直接快速有效的診斷手段，其篩選與獲得可在腫瘤診斷、發(fā)展、治療以及療效監(jiān)測等多個(gè)方面發(fā)揮重要的作用，因此成為研究的熱點(diǎn)及重點(diǎn)。由于MALDI IMS技術(shù)不需要事先知道靶分子的信息，不僅能夠監(jiān)測未知的分子，而且可對(duì)眾多分子的空間分布進(jìn)行定位，因此為快速獲得及篩選生物標(biāo)志物帶來了極大的可能。

圖1 腫瘤切片的掃描圖（A）和MALDI IMS圖（B）

圖2 腫瘤正常部位（ROI 1）和腫瘤壞死部位（ROI 2）質(zhì)譜圖

本文采用部分壞死的結(jié)腸癌組織切片作為研究對(duì)象，從腫瘤正常部位（ROI 1）和腫瘤壞死部位（ROI 2）質(zhì)譜圖（圖2）比較中，可以看出3348Da和6277Da 2種蛋白在腫瘤正常部位和壞死部位差異比較大。圖1B顯示了這2種差異蛋白的空間分布，從圖中可以看出：3348Da的蛋白主要分布在正常腫瘤組織中，而6277Da的蛋白主要分布在腫瘤壞死的部位。因此，MALDI IMS結(jié)果顯示6277Da的蛋白可以作為結(jié)腸癌腫瘤組織壞死的生物標(biāo)志物。

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