顏偉玉，謝國秀，丁黃潔，吳小波，王子龍

(1江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045;2江西省職業(yè)病防治研究院，江西 南昌 330006)

蜂膠是工蜂從植物幼芽或樹干破傷部位采集來的樹脂，并混入上顎腺分泌物和蜂蠟等加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物，被譽為“紫色黃金”[1]。蜂膠富含藥理學(xué)活性成分，如多酚類黃酮化合物、醛及酮類化合物、萜類化合物、甾類化合物等[2－3]。蜂膠具有廣泛藥理功效，有天然抗生素之稱，具有增強免疫、抗菌、抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤等生物學(xué)活性[4－11]。但蜂膠難溶于水，進入消化道后不易被人體吸收和利用，給臨床應(yīng)用帶來了困難。

納米技術(shù)作為科技領(lǐng)域的熱門課題，已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。近年來研究發(fā)現(xiàn)，采用納米技術(shù)將蜂膠制成納米顆粒，其理化性質(zhì)和作用發(fā)生了驚人變化，可以有效地改變納米蜂膠顆粒的表面物化性質(zhì)，提高蜂膠與水等溶劑的親和性[12]。與常規(guī)的粘稠蜂膠相比，納米蜂膠有更強的親水性和更活潑的化學(xué)性質(zhì)，進入人體的消化系統(tǒng)也極易被吸收利用;同時，納米級的蜂膠顆粒改變了其表面結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生具有納米粒子特有的表面界面效應(yīng)，從而提高了蜂膠的抗腫瘤、抗氧化、抗病原微生物、抗菌消炎、增強免疫、促進組織再生等廣泛的生物學(xué)作用。國內(nèi)不少學(xué)者對納米復(fù)合蜂膠的制備工藝進行了探討[13－17]，并對納米蜂膠的抑菌性、抗氧化性、抗腫瘤及增強免疫等方面進行了研究[18－19]。李雅晶等采用β－環(huán)糊精包埋制備納米蜂膠，并對納米蜂膠的體外藥劑學(xué)性質(zhì)進行了研究，結(jié)果表明載藥量達29.65%，包封率為98.82%，藥物具有明顯的緩效應(yīng)[20－21]。但對納米蜂膠降血脂方面的研究甚少，為了探明納米蜂膠在該方面的功效，本研究將蜂膠制成納米材料，對大鼠降血脂和抗氧化效果進行了探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠48只，雄性，SPF級，體質(zhì)量189～217 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供(生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2009－0004)。動物飼養(yǎng)于江西省職業(yè)病防治研究院動物房(使用許可證號:SYXK(贛)2008－0003)，動物房溫度20～25℃;相對濕度51% ～55%。

1.1.2 藥物與試劑 蜂膠，醋酸乙酯，吐溫－80，司盤－80，去離子水，膽固醇(上海政翔化學(xué)試劑研究所生產(chǎn));膽鹽(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn));血清膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒和高密度酯蛋白試劑盒由四川省邁克科技公司生產(chǎn)。高脂滅菌飼料:78.2%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽酸鈉。由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2009－0012)

1.1.3 主要儀器 Zeta粒度儀(美國BIC公司制造);透射電子顯微鏡(日本島津公司);恒溫磁力攪拌器;超凈工作臺;酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米蜂膠的制備方法 本研究以乙酸乙酯為油相，吐溫－80和司盤－80為表面活性劑，按一定比例配成納米蜂膠水分散體系。在乙酸乙酯溶液中加入蜂膠，常溫下充分溶解1 d后，制成飽和溶液，取上清液置于燒杯中，按比例加入表面活性劑，在通風(fēng)櫥中用回流管逐滴加入去離子水，同時置于攪拌器上攪拌，混勻。然后在通風(fēng)櫥中揮發(fā)1 d，去除乙酸乙酯。

1.2.2 納米蜂膠粒徑的測定 取適量納米蜂膠用激光粒度分析儀測定納米粒的粒徑進行檢測，每個樣本測量5次。

1.2.3 粒子表面形態(tài)的觀察 取納米粒乳液少量，滴在蓋玻片上，自然晾干。噴金后用透射電子顯微鏡(SEM)觀察粒子的表面形態(tài)。

1.2.4 溶解度的測定 室溫下，用天平稱取該蜂膠10.0 g，加入到500 mL的乙酸乙酯溶液中，常溫下浸泡并充分溶解1 d，制成飽和溶液，用7 000 r/min，離心15 min，取沉淀用烘箱干燥，測殘渣重5.205 g，根據(jù)所加蒸餾水的量計算得溶解度為:9.59 mg/mL。

1.2.5 實驗劑量與分組 實驗設(shè)3個劑量組和1個對照組，根據(jù)TC值隨機分組，每組10只，各組劑量如下:高劑量組800 mg/(kg·d)bw、中劑量組 400 mg/(kg·d)bw、低劑量組200 mg/(kg·d)bw。對照組在喂飼相同飼料的同時，經(jīng)口給予同量的溶劑。

1.2.6 實驗給藥及動物處理 大鼠喂飼基礎(chǔ)飼料5 d，眼眶取血，測定血清總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL－C)水平。根據(jù)TC水平，隨機分為3個給藥劑量組和一個對照組，在給予高脂飼料的同時經(jīng)口給予不同劑量的受試樣品。

給藥途徑:各劑量組每天經(jīng)口給予受試樣品1次，灌胃量1 mL/(100 g)bw，給受試樣品時間45 d。對照組給予同量的超純水。

日常觀察:每日觀察大鼠的活動、進食及飲水情況，每周用電子稱稱量大鼠體質(zhì)量;實驗結(jié)束前16 h(隔夜)禁食。處死前稱體質(zhì)量并取腹股動脈血，利用試劑盒測定血清TC、TG、HDL－C水平。

1.2.7 H2O2誘導(dǎo)氧化溶血試驗 取新鮮抗凝全血，經(jīng)生理鹽水洗滌、離心3次(每次3 000 r/min，5 min，最后1次10 min)，去血漿及白細胞層，制成壓積紅細胞，加生理鹽水配制成體積份數(shù)為1%的紅細胞懸液。

將每個樣本的紅細胞懸液分為A、B兩管，每管2 mL。A管加2 mL H2O2(終濃度100 mmol/L)混勻。B管加2 mL蒸餾水，混勻。上述兩管各于37℃水浴箱溫浴30 min。3 000 r/min離心5 min。各管分裝入96孔板中，酶標儀以490 nm光波檢測。

溶血度=(A管吸光值÷B管吸光值)×100%(1)1.2.8 數(shù)據(jù)處理 用Dunnett t(2－sided)統(tǒng)計方法，3個劑量組各指標均數(shù)均與對照組的均數(shù)進行兩兩比較，檢驗統(tǒng)計學(xué)差異。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，顯著性檢驗采用單因素方差分析和t檢驗，顯著性差異界限值為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米蜂膠的粒徑和表面形態(tài)

納米蜂膠為棕褐色，均勻混濁的液體，其中蜂膠含量為9.59 mg/mL。經(jīng)激光粒度分析儀測得納米蜂膠的平均粒徑為270 nm。經(jīng)電鏡觀察，蜂膠顆粒大小均勻的球形粒子(工作電壓75 KV，放大倍數(shù)120×1 000)，見圖1。

2.2 納米蜂膠對大鼠降血脂功能影響

2.2.1 納米蜂膠對大鼠體重的影響 試驗期間，各組動物生長情況良好，無異常行為。試驗中，中劑量組及高劑量組各死亡1只大鼠，經(jīng)尸檢未見肝、脾、腎、肺、心等器質(zhì)性病變，考慮為灌胃等實驗操作所致。各組剩余大鼠數(shù)量均在8～12只的范圍內(nèi)，符合本試驗要求。各組大鼠體重穩(wěn)步增長，每周平均體質(zhì)量均無顯著性組間差異(P＞0.05)。試驗終止前，禁食后高劑量組平均體質(zhì)量(終體質(zhì)量)與對照組比較顯著偏低(P＜0.05)，其余各組無顯著性差異(P＞0.05)，結(jié)果見表1。

圖1 納米蜂膠掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 The SEM micrograph of nanometer propolis

表1 納米蜂膠對大鼠周平均體質(zhì)量的影響Tab.1 Effect of nanometer propolis on average weight of rats g

2.2.2 納米蜂膠對大鼠血脂的影響 試驗結(jié)束時，模型對照組血清總膽固醇與初始分組時比較有明顯提高，有極顯著性差異(P＜0.05)，表明本次試驗造模成功。喂食蜂膠45 d試驗結(jié)束時各劑量組與對照組比較總膽固醇有所降低，但未見顯著性差異(P＞0.05)。試驗結(jié)束后各劑量組的高密度脂蛋白及血清甘油三酯與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)，結(jié)果見表2。

2.2.3 納米蜂膠H2O2誘導(dǎo)氧化溶血的比較 各試驗組大鼠的新鮮紅細胞經(jīng)100 mmol/L的H2O2氧化處理后，均出現(xiàn)輕微溶血，溶血度在1.36% ～1.54%。對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量間均差異不顯著(P ＞0.05)。

表2 納米蜂膠對大鼠血脂的影響Tab.2 Effect of nanometer propolis on lipoidemia of rats

表3 H2O2誘導(dǎo)氧化溶血比較Tab.3 Comparation of hemolysis of red blood cell induced by H2O2

3 討論

納米蜂膠溶液制備時采用最大溶解度，所得納米蜂膠溶液濃度9.59 mg/mL，與魯傳華報道的納米蜂膠水分散體和李雅晶用β－環(huán)糊精包埋制備的納米蜂膠相比濃度偏低[14，21]，但與楊道鋒研究納米蜂膠對腫瘤細胞殺傷效應(yīng)中的6 mg/mL濃度相比偏高。所制備的納米蜂膠徑粒為270 nm，分散性較好。

高血脂病是心血管疾病之一，也是導(dǎo)致動脈粥樣硬化(AS)和心腦血管病變的重要因素，目前已成為主要的老年疾病，也是當今危害人類健康的主要疾病。曾志將等實驗報告指出蜂膠能明顯降低高脂血癥大鼠血清中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量[10]。將蜂膠制成納米顆粒是否可以增強其藥效，促進機體吸收，從而增加其降血脂的功效尚不清楚。本實驗結(jié)果表明，納米蜂膠高劑量組顯著降低了大鼠體重，大鼠血清中的總膽固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白與對照組比較雖有降低趨勢，但并無顯著差異。分析原因，可能大鼠飼喂納米蜂膠的最佳劑量需要進一步進行摸索或調(diào)整，也可能動物實驗周期需要進一步延長才具有顯著效果。各實驗組大鼠新鮮紅細胞H202氧化處理后，均出現(xiàn)了輕微的溶血，但納米蜂膠組有降低溶血度的趨勢，說明食用納米蜂膠對增強紅細胞抗脂質(zhì)過氧化的能力有一定作用。

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