譚樹乾， 尹 姣， 李克斌， 束長龍，劉春琴， 曹雅忠＊， 仵均祥

（1.旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，西北農(nóng)林科技大學應用昆蟲學重點實驗室，楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3.滄州市農(nóng)林科學院，滄州 061001）

Cry8Ga1蛋白對華北大黑鰓金龜幼蟲主要酶活性的影響

譚樹乾1，2， 尹 姣2， 李克斌2， 束長龍2，劉春琴3， 曹雅忠2＊， 仵均祥1＊

（1.旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，西北農(nóng)林科技大學應用昆蟲學重點實驗室，楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3.滄州市農(nóng)林科學院，滄州 061001）

華北大黑鰓金龜［Holotrichiaoblita（Faldermann）］是一種危害嚴重的地下害蟲，Cry8Ga1蛋白對其幼蟲具有明顯殺蟲活性。本文比較了華北大黑鰓金龜幼蟲取食Cry8Ga1蛋白后6種酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)取食高濃度（5×LC50，50.767μg／g土）Cry8Ga1蛋白幼蟲的總蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶、乙酰膽堿酯酶（AChE）、谷胱甘肽－S－轉移酶（GST）以及氨肽酶（APN）的活性較對照均有不同程度的升高，在大多數(shù)處理時段差異顯著（P＜0.05），其中高濃度處理組的GST酶活性在12h后升高倍數(shù)最大，是同時段對照的23.37倍；而取食低濃度（0.5×LC50，5.076 7μg／g土）Cry8Ga1蛋白時，乙酰膽堿酯酶和氨肽酶活性無明顯差異（P≥0.05）。類胰蛋白酶在整個試驗中活性變化與對照相比僅有個別處理時段存在差異，由此推斷，類胰蛋白酶不是華北大黑鰓金龜幼蟲對Cry8Ga1蛋白的主要活化酶。關鍵詞 大黑鰓金龜； Bt； Cry8Ga1； 酶活性

華北大黑鰓金龜［Holotrichiaoblita（Faldermann）］屬鞘翅目（Coleoptera）金龜總科（Scarabaeoidea），是我國華北、黃淮海和東北等地區(qū)地下害蟲的優(yōu)勢種之一，其幼蟲（蠐螬）主要為害小麥、花生、大豆、玉米、高粱、馬鈴薯等，發(fā)生危害嚴重［1］。大黑鰓金龜因棲息在土壤中，隱蔽危害，加之生活世代長，因而難以測報和防治。

目前對蠐螬防治主要依靠化學農(nóng)藥，而化學農(nóng)藥對農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境污染嚴重［2］。蘇云金芽胞桿菌（BacillusthuringiensisBerliner，Bt）能在土壤中自然生長繁殖，不污染環(huán)境，對人畜無害。對金龜子科害蟲具有殺蟲作用的cry類基因的發(fā)現(xiàn)和克隆，為此類害蟲的防治提供了一種新型的綠色途徑。Ohba等1992年首次篩選出對金龜子幼蟲具有高效殺蟲活性的Bt菌株之后［3］，國內外對蠐螬有殺蟲活性的Bt菌株的研究和報道便屢見不鮮［4－7］。

經(jīng)典的Cry蛋白殺蟲機理主要分為四步：晶體蛋白在敏感昆蟲中腸內溶解；中腸蛋白酶對原毒素進行消化，并釋放出活性多肽；活性多肽與中腸膜受體結合；活性多肽插入中腸細胞表皮膜形成離子通道或孔道，打破中腸腸道細胞的滲透平衡，細胞病變，導致昆蟲死亡［8］。其中昆蟲取食Bt蛋白后一些解毒酶和蛋白酶的活性變化是影響B(tài)t毒性的重要因素。目前，國內外的這類研究以鱗翅目居多，鞘翅目害蟲很少見。本研究主要對華北大黑鰓金龜幼蟲取食Cry8Ga1蛋白后體內相關酶活性進行測定，以探索Cry8Ga1蛋白對華北大黑鰓金龜幼蟲酶活性的影響，為Cry8Ga1蛋白應用于蠐螬的防治研究以及Bt殺蟲作用機理的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲

蟲源由河北省滄州市農(nóng)林科學院提供。田間捕捉華北大黑鰓金龜成蟲，在室內用榆樹葉飼養(yǎng)至產(chǎn)卵，將卵放入塑料盒內孵化。選5～7日齡幼蟲進行試驗處理。

1.1.2 供試Bt蛋白

攜帶Cry8Ga1蛋白的菌株HD8Ga由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所生物技術組提供。

菌株接入牛肉膏液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至芽胞釋放。12 000r／min離心15min，用少量無菌水懸浮沉淀，制成晶胞懸液，測定其Cry8Ga1蛋白含量。液氮冷凍后－80℃保存。參照Shu Changlong發(fā)表的Cry8Ga1蛋白對大黑鰓金龜?shù)?LC50（10.153 4μg／g土）［9］，將晶胞懸液稀釋成0.5×LC50和5×LC50兩個濃度，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

用濃度為0.5×LC50和5×LC50的晶胞懸液浸泡干燥的馬鈴薯絲20min后，再將稱好的滅菌土倒入其中與其拌勻作為飼料，以無菌水拌土作對照。土與晶胞懸液或水的質量比為5∶1，土與馬鈴薯絲的質量比為23∶1。用制備的飼料飼喂6孔板中饑餓處理6h的5～7日齡華北大黑鰓金龜幼蟲，28℃環(huán)境飼養(yǎng)。飼喂處理12、24、36、48、60、72h后取樣，每次取3頭幼蟲，經(jīng)液氮冷凍后－80℃保存。試驗重復3次。將冷凍保存的華北大黑鰓金龜幼蟲放入玻璃勻漿器中，加1mL預冷的0.15mol／L NaCl溶液，冰上勻漿。勻漿液4℃、12 000r／min離心20min，取上清液作為酶液，備用。

1.2.2 酶活性測定

總蛋白酶的活性測定參照王琛柱等的方法［10］，將偶氮酪蛋白（azocasein）用0.15mol／L的 NaCl溶液溶解成2mg／mL。將10μL酶液、100μL偶氮酪蛋白溶液和40μL 50mmol／L的甘氨酸－氫氧化鈉緩沖液（pH10.0）混合，于30℃反應3h，然后加入70μL預冷的10%（質量／體積）三氯乙酸終止反應，反應混合物在4℃、12 000g下離心20min，取60μL上清液和40μL 1mmol／L的NaOH溶液混合，在410nm測吸光值。

類胰蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶以及氨肽酶的活性測定參照魏紀珍等的方法［11］。其中類胰蛋白酶活性測定略作修改，以BAPNA作為底物，用二甲基亞砜（DMSO）將底物溶解成1mmol／mL。將40μL酶液、80μL底物和40μL 50mmol／L甘氨酸－氫氧化鈉（pH 10.0）緩沖液加入酶標板中，410nm處讀取吸光值，每15s讀一次，持續(xù)30min。

乙酰膽堿酯酶的活性測定參照張炬紅等的方法［12］。

谷胱甘肽轉移酶活性測定參照Habig的方法［13］，用乙醇將 CDNB 溶解成 1.2mmol／L 的溶液，用0.1mol／L、pH 為7.6的磷酸緩沖液（PBS）將GSH溶解成6mmol／L的溶液。將80μL的PBS、20μL酶液、100μL的CDNB和100μL的GSH溶液加入96孔酶標板中，在340nm下讀取吸光值，每15s讀一次，持續(xù)15min。

1.2.3 可溶性總蛋白測定

以牛血清蛋白BSA為標準蛋白，參照Bradford方法測定，每樣品重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0分析軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，采用Duncan法和t測驗方法對不同處理進行差異性檢驗。

2 結果與分析

2.1 總蛋白酶

測試結果（圖1）表明，5×LC50（高濃度）處理的華北大黑鰓金龜幼蟲體內總蛋白酶活性在12、36、48、60h和72h，與對照相應時段相比顯著升高（P＜0.05），并在12h上升幅度最大，與對照相比上升6.77倍。0.5×LC50（低濃度）處理除48h的存在顯著差異（P＜0.05）之外其余時間段的與對照間差異不顯著（P≥0.05），但也較對照上升。兩個濃度處理組之間變化趨勢基本相同，但高濃度處理組總蛋白酶活性在各處理時段均高于低濃度處理組，除24、60h和72h處理時段之外在其他5個相應處理時段間存在顯著差異（P＜0.05）；48h之前總體上升，并都在48h達到最高，隨后下降。

圖1 大黑鰓金龜幼蟲總蛋白酶活性的變化Fig.1 The activity changes of total protease

2.2 類胰凝乳蛋白酶

從圖2可以看出，5×LC50處理的華北大黑鰓金龜幼蟲類胰凝乳蛋白酶活性在12、36、48h和60h，與對照相比顯著升高（P＜0.05），在48h達到最高點。12h時比對照提高9.99倍，在各處理時段中最高。0.5×LC50處理一直上升，并在48h后與對照有顯著差異（P＜0.05）。兩濃度處理組間除24h和72h處理時段之外均有顯著差異（P＜0.05）。

圖2 大黑鰓金龜幼蟲類胰凝乳蛋白酶活性的變化Fig.2 The activity changes of chymotrypsin－like

2.3 類胰蛋白酶

如圖3所示，5×LC50濃度處理的華北大黑鰓金龜幼蟲類胰蛋白酶活性在12h達到最高點，與對照相比顯著升高（P＜0.05），然后明顯下降，36h時開始緩慢上升（無顯著差異P≥0.05），到60h時類胰蛋白酶活性出現(xiàn)第2次小高峰，并與對照相比存在顯著差異（P＜0.05）；隨后再次下降。而0.5×LC50（低濃度）處理與高濃度（5×LC50）處理明顯不同，類胰蛋白酶活性僅在48h時出現(xiàn)一個高峰，并與對照和高濃度（5×LC50）處理間差異顯著（P＜0.05）；其他處理時段均與對照相似（P≥0.05）。

圖3 大黑鰓金龜幼蟲類胰蛋白酶活性的變化Fig.3 The activity changes of trypsin－like

2.4 谷胱甘肽－S－轉移酶

處理后的蟲體谷胱甘肽－S－轉移酶（GST）活性均高于對照（見圖4）。5×LC50處理的大黑鰓金龜幼蟲GST活性在不同處理時段變化較大；其中，在12h時活性較高，到24h時明顯下降，在36h時有所上升，在48h時達到最高，隨后再迅速下降；但始終顯著高于對照（P＜0.05）其中12h與對照相差倍數(shù)最大，是對照的23.37倍。而高濃度（0.5×LC50）處理幼蟲的GST活性除在24h和72h之外，其余時間明顯高于0.5×LC50處理（P＜0.05）。0.5×LC50處理與對照無顯著差異，趨勢平穩(wěn)。

圖4 大黑鰓金龜幼蟲谷胱甘肽－S－轉移酶活性的變化Fig.4 The activity changes of GST in Holotrichiaoblitalarvae

2.5 乙酰膽堿酯酶

測試結果（圖5）顯示，經(jīng)飼喂Cry8Ga1蛋白的混合飼料高濃度（5×LC50）處理后，華北大黑鰓金龜幼蟲體內乙酰膽堿酯酶（AChE）活性與對照相比處于升高水平，除24、36h和72h外，其他處理時段幼蟲的乙酰膽堿酯酶活性均顯著高于對照（P＜0.05），其中在48h處理時段AChE的活性達到高峰，與對照相比提高了3.47倍。而低濃度（0.5×LC50）處理組幼蟲的乙酰膽堿酯酶活性，雖然在48h后達到最高，但總體來看0.5×LC50的濃度處理與對照差異不顯著（P≥0.05）。兩濃度處理組之間AChE活性的變化趨勢基本一致，但高濃度處理組在12、24、48h和60h處理時段均顯著高于低濃度處理組（P＜0.05）。

圖5 大黑鰓金龜幼蟲乙酰膽堿酯酶活性的變化Fig.5 The activity changes of AShE

2.6 氨肽酶

華北大黑鰓金龜幼蟲經(jīng)兩種濃度Cry8Ga1蛋白的混合飼料飼喂處理后，體內氨肽酶（APN）活性發(fā)生了不同程度的變化（圖6）。高濃度（5×LC50）處理組幼蟲的氨肽酶活性變化表現(xiàn)為升高－下降－再升高－再下降的趨勢，其中在36h達到最高點；與對照相比，48h提高倍數(shù)最大，達到7.67倍；除24h和72h處理時段外，其他處理時段幼蟲的氨肽酶活性與對照和低濃度（0.5×LC50）處理組相比均顯著升高（P＜0.05）。而0.5×LC50（低濃度）處理組的變化較平穩(wěn)，僅在48h出現(xiàn)一個高峰點，各處理時段APN的活性均與對照無顯著差異（P≥0.05）。

圖6 大黑鰓金龜幼蟲氨肽酶活性的變化Fig.6 The activity changes of APN in

3 結論與討論

通過對華北大黑鰓金龜幼蟲飼喂Cry8Ga1蛋白兩種濃度（5×LC50和0.5×LC50）混合食物，然后分不同時段測試其幼蟲6種相關酶活性的結果表明，幼蟲的總蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶、乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽－S－轉移酶、氨肽酶以及類胰蛋白酶的活性比對照均有不同程度的升高；其中前5種酶的活性有明顯上升，而類胰蛋白酶活性變化不夠明顯?？傮w來看，高濃度（5×LC50，50.767μg／g土）處理組幼蟲的6種酶活性在72h范圍內不同時段的變化，均表現(xiàn)為先升高（12h）—下降（24h）—再升高（48h或36h）—再下降的趨勢；0.5×LC50（低濃度）處理組的6種酶活性變化平穩(wěn)，與對照相比大多無顯著差異。

在Cry蛋白對昆蟲的作用中，只有被蛋白酶活化之后才能對昆蟲有毒殺活性，昆蟲中腸蛋白酶與Bt蛋白的毒性密切相關。Oppert等認為絲氨酸蛋白酶類是Bt蛋白的主要消化酶［14］。張少燕等對棉鈴蟲幼蟲的研究也發(fā)現(xiàn)類胰凝乳蛋白酶的活性隨Bt蛋白濃度增大而顯著升高［15］。從本文結果中可以看出，取食Cry8Ga1蛋白使華北大黑鰓金龜幼蟲總蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶的活性較對照上升，且其活性隨處理濃度的增加而上升；無論是高濃度處理還是低濃度處理，幼蟲類胰蛋白酶活性較對照變化均不夠明顯。由此可以推測，在華北大黑鰓金龜幼蟲體內，對Cry8Ga1蛋白活化起主要作用的可能是總蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶；總蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶活性的升高可以使更多的Cry8Ga1蛋白轉化為毒性多肽，其毒性增加。

谷胱甘肽－S－轉移酶和乙酰膽堿酯酶是昆蟲體內重要的解毒酶。陸瓊等研究發(fā)現(xiàn)Cry2Ab蛋白處理的小地老虎初孵幼蟲谷胱甘肽－S－轉移酶活性上升［16］。本文中華北大黑鰓金龜幼蟲處理后谷胱甘肽轉移酶活性上升趨勢明顯，并與取食Bt的Cry8Ga1蛋白濃度成正相關。宋健等對侵染Bt的銅綠麗金龜幼蟲的乙酰膽堿酯酶酶活性測定，結果顯示銅綠麗金龜乙酰膽堿酯酶活性上升［17］。本文中乙酰膽堿酯酶活性在低濃度處理時無明顯變化，而高濃度處理組在3個時間段有顯著上升。這些結果說明在取食Cry8Ga1蛋白的最初72h內，華北大黑鰓金龜幼蟲的谷胱甘肽－S－轉移酶和乙酰膽堿酯酶可能參與了對Cry8Ga1蛋白的解毒作用，華北大黑鰓金龜幼蟲在開始受到Bt蛋白的不利刺激時有一定的自衛(wèi)能力。然而，這個現(xiàn)象是否與Cry8Ga1蛋白對大黑鰓金龜毒殺效果緩慢有關，還需要進一步研究。

魏紀珍等在研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Cry1Ac處理后棉鈴蟲蛋白酶活性變化主要表現(xiàn)在12h，Cry2Ab處理后其酶活力最高的變化出現(xiàn)在36h［11］，表明不同Cry蛋白在不同昆蟲中腸中活化的時間有所不同。本試驗中，Cry8Ga1處理華北大黑鰓金龜幼蟲后，其總蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶、類胰蛋白酶活性出現(xiàn)較大變化是在兩個時間點，它們分別是12h和48h。作者推測，華北大黑鰓金龜幼蟲從開始取食Cry8Ga1蛋白到其死亡之前，Cry8Ga1蛋白可能在多個時間點活化，即蛋白酶活性升高的峰值可能會多于一個。隨著蛋白酶活性升高，被活化的Cry8Ga1蛋白增多，毒性增大，華北大黑鰓金龜幼蟲解毒酶（乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽－S－轉移酶）活性也在相應時間內升高。但其酶活性的動態(tài)機制尚需深入研究。

氨肽酶在昆蟲體內不僅有消化蛋白的作用，在鱗翅目昆蟲中還是一種重要的Bt受體。2000年Santos還發(fā)現(xiàn)其有信號轉導的作用［18］。本試驗中，氨肽酶在低濃度處理下變化不明顯，而高濃度則明顯升高。這說明，高濃度Cry8Ga1蛋白可誘使氨肽酶的活性升高。而氨肽酶的3種不同作用在Cry8Ga1蛋白對華北大黑鰓金龜幼蟲毒殺過程中是怎樣協(xié)調的，尚待明確。

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Effects of Cry8Ga1 toxin on the activities of main enzymes inHolotrichiaoblitalarvae

Tan Shuqian1，2， Yin Jiao2， Li Kebin2， Shu Changlong2， Liu Chunqin3， Cao Yazhong2， Wu Junxiang1
（1.StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas，KeyLaboratoryofAppliedEntomology，Northwest A＆FUniversity，Yangling712100，China；2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests，InstituteofPlantProtection，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；3.CangzhouAcademyofAgriculturalandForestrySciences，Cangzhou061001，China）

Holotrichiaoblita，an underground insect pest，causes serious damages on crops in China.It is well known that Cry8Ga1 has a larvicidal activity againstH.oblita.In this study，the larvae ofH.oblitawas fed with two concentrations of Cry8Ga1.Subsequently，the activities of 6 enzymes were assayed.It was found that when only applied with higher concentration of Cry8Ga1（5×LC50，50.767μg／g soil），the activities of total protease，chymotrypsin－like enzyme，acetylcholinesterase （AChE），glutathione－S－transferase （GST）and aminopeptidase（APN）in larvae would significantly rise in most time of the experiment（P＜0.05）.And the GST activity after 12 h in higher－concentration group was 23.37 times as much as the control，which was the largest multiple of the elevatory enzymes activities.However，the differences of the activities of AChE and APN in larvae were insignificant between the lower concentration（0.5×LC50，5.076 7μg／g soil）group and control（P≥0.05）.The activities of the trypsin－like enzyme showed difference occasionally.It is therefore deduced that the elastase－like proteinases were not the main digestive enzymes of Cry8Ga1 in the larvae ofH.oblita.

Holotrichiaoblita； Bt； Cry8Ga1； enzyme activity

S 476

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2013.03.001

2012－11－09

2012－11－19

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003025）；國家自然科學基金（31000853）

＊ 通信作者曹雅忠，Tel：010－62815619，E－mail：yzcao＠ippcaas.cn；仵均祥，E－mail：junxw＠nwsuaf.edu.cn