樊玉祥，何文婷 ，李沫函 ，王雪嬌 ，張洪亮

(1、新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤二科，新疆 烏魯木齊 830000；2、新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

胃癌目前是亞洲地區(qū)第二大致死性疾病，在我國發(fā)病率居消化道腫瘤第一位[1]，積極的外科治療仍是治療早期胃癌的主要手段[2]。但是手術(shù)治療或其聯(lián)合放化療治療進(jìn)展期胃癌仍存在巨大的困難[3，4]，如手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、痛苦，放化療的毒副反應(yīng)等，患者往往難以耐受。近年來中藥在抗腫瘤方面作用機(jī)制的研究越來越受到多方學(xué)者的重視[5]。早在上世紀(jì)70年代，我國學(xué)者就報(bào)道了由新疆道地藥材駱駝蓬中提取的去氫駱駝蓬堿及駱駝蓬堿具有抗消化道腫瘤的作用，同時(shí)有多種制劑應(yīng)用于臨床，取得了一定的療效。駱駝蓬中主要成分為β-咔啉類生物堿[6，7]，但目前抗腫瘤機(jī)制尚不清楚。本次實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的β-咔啉類生物堿誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡，為研究β-咔啉類生物堿誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)選擇一種合適的檢查細(xì)胞凋亡的方法對(duì)觀察效果起著決定性的作用。故本次實(shí)驗(yàn)采用MTT法、Hoechest33258細(xì)胞核染色法、流式細(xì)胞檢測觀察細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人胃癌SGC-7901細(xì)胞 (中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)，β-咔啉類生物堿 (北京中醫(yī)藥大學(xué)劉永剛教授惠贈(zèng))MTT、DMSO、Hoechest33258(Sigma 公 司 )，Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貝博)，酶標(biāo)儀(Thermo，1500)，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 (MILLIPORE guava easy-Cyte 8HT)，熒光掃描儀(BIO-RAD Gel DocTMXR+)，熒光顯微鏡 (萊卡，DMI6000B)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞分別接種于96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%二氧化碳濃度細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，按不同濃度給藥，隨機(jī)分為5組(A組40μg/ml，B 組 20 μg/ml，C 組 10 μg/ml，D 組 5 μg/ml，E空白對(duì)照組，所示濃度為終濃度)，藥物作用24h、48h后收集細(xì)胞，分別用MTT法、Hoechest33258細(xì)胞核染色、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.2 MTT法觀察細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/ml接種于 96孔板，置于37℃、5%二氧化碳濃度細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12h，觀察細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，按以下濃度給藥A組40μg/ml，B 組 20 μg/ml，C 組 10 μg/ml，D 組 5 μg/ml，E空白對(duì)照組，同時(shí)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物作用24h、48h 后，每孔加入 50μl MTT(5g/L)繼續(xù)孵育4h。棄去孔內(nèi)上清液，每孔加入150μl DMSO，均勻震蕩10min，見藍(lán)色結(jié)晶完全溶解后，立即使用酶標(biāo)儀測定每孔在570nm處的吸光度值(A)，用以下公式計(jì)算不同藥物濃度作用24h、48h后細(xì)胞的生長抑制率，并用計(jì)算出半數(shù)抑制率(IC50)[7]。細(xì)胞生長抑制率=[(A對(duì)照-A加藥)/A對(duì)照]×100%。

1.2.3 Hoechest33258細(xì)胞核染色法 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml，接種于小號(hào)培養(yǎng)皿中，每皿1ml細(xì)胞懸液。置于37℃、5%二氧化碳濃度細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12h，觀察細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，按以下濃度給藥A組40μg/ml，B組 20 μg/ml，C 組 10 μg/ml，D 組 5μg/ml，E 空白對(duì)照組，藥物作用24h、48h后加入1mg/ml的Hoechest33258 10μl，繼續(xù)孵育 20min，使用 PBS 仔細(xì)清洗2遍后封片，在避光條件下使用熒光顯微鏡觀察。觀察后并照相，計(jì)算凋亡細(xì)胞核百分率。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，待其自然生長至細(xì)胞濃度約3×106個(gè)/ml時(shí),按以上不同濃度給藥，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h、48h后收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/ml，用 PBS 洗 2 次，加入 50μl Rnase(10μg/ml)和 200μl PI(5μl/ml)，4℃避光孵育 30min，上機(jī)測定細(xì)胞周期，用Guava cell cycle軟件收取細(xì)胞，用Guava cell cycle軟件分析細(xì)胞凋亡，結(jié)果以凋亡細(xì)胞的百分率表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用析因設(shè)計(jì)單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法顯示不同濃度β-咔啉類生物堿對(duì)細(xì)胞增殖的影響 分別以 40μg/ml、20 μg/ml、10μg/ml、5μg/ml濃度的β-咔啉類生物堿處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞24h、48h后，細(xì)胞生長均成不同程度的抑制，且抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)(表1)。藥物作用 24h 后 IC50=17.79μg/ml。

表1 MTT法顯示不同濃度β-咔啉類生物堿對(duì)細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=6,%)

2.2 Hoechest33258細(xì)胞核染色觀察 Hoechest33258可通過完整的細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞毒性較低，在熒光激發(fā)后可顯示藍(lán)紫色光。正常細(xì)胞核染色特點(diǎn)為：核染色疏松細(xì)致，核仁大而清晰。予以不同濃度的β-咔啉類生物堿處理24h、48h后在熒光顯微鏡下觀察：細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)在局部區(qū)域內(nèi)凝集，致密濃染，部分可見核碎裂，出現(xiàn)凋亡小體。各組細(xì)胞核凋亡率見表2。(圖略)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測β-咔啉類生物堿對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞技術(shù)顯示：A組24h凋亡率為 (41.423±4.192)%，48h凋亡率為(49.542±3.858)%，B組 24h凋亡率為 (30.667±4.433)%，48h凋亡率為(34.875±4.748)%，C組 24小時(shí)凋亡率為 (20.325±2.571)%，48h凋亡率為23.345±2.721，D 組 24h 凋 亡 率 為 11.275±3.147，48h 凋亡率為 15.298±3.473，E 組 24h 凋亡率為 1.662±2.141，48h 凋亡率為 3.848±2.491。具體結(jié)果見表3。由結(jié)果可以得知，不同濃度的藥物對(duì)細(xì)胞均有不同程度的誘導(dǎo)凋亡的作用(分別與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01)，且隨濃度的升高，細(xì)胞凋亡率亦隨之增加。

表2 Hoechst33258細(xì)胞核染色后觀察細(xì)胞核凋亡百分率(x±s,n=6,%)

表3 流式細(xì)胞儀分析不同濃度β-咔啉類生物堿作用后細(xì)胞凋亡率變化(x±s,n=6,%)

3 討論

目前常用的評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的方法有：(1)細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)，主要是光學(xué)顯微鏡的檢測，它仍是區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死的最基本和最重要的手段。(2)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡細(xì)胞的檢測。尤其可檢測出亞G1期細(xì)胞，它的出現(xiàn)被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。(3)DNA斷裂檢測。(4)原位末端標(biāo)記技術(shù)。細(xì)胞凋亡對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)意義在于，細(xì)胞DNA損傷可誘導(dǎo)抑癌基因p53的表達(dá)，使細(xì)胞停滯在G1期，以便提供足夠的時(shí)間對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，在細(xì)胞損傷嚴(yán)重以致無法修復(fù)的情況下，p53則觸發(fā)細(xì)胞凋亡。本次實(shí)驗(yàn)的目的在于通過多種手段觀察β-咔啉類生物堿是否能夠誘導(dǎo)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡。

MTT比色法是一種最常用的檢測細(xì)胞存活和生長的方法，操作相對(duì)簡單，對(duì)檢測設(shè)備要求較低，常用于藥物活性的篩選[9，10]。本次實(shí)驗(yàn)中通過MTT比色法可用A值直接計(jì)算出不同濃度藥物的抑制率，通過抑制率可計(jì)算出IC50，為下一步的細(xì)胞毒理學(xué)及相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，該方法所得結(jié)果誤差較大，需多次、反復(fù)操作，以校正結(jié)果。

Hoechest33258染料溶于水和有機(jī)溶劑，可穿透細(xì)胞膜，結(jié)合于活細(xì)胞或固定過的細(xì)胞，故可用于活細(xì)胞的標(biāo)記[11]。在本次試驗(yàn)中我們可以觀察到，β-咔啉類生物堿可對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞核造成損害，具體表現(xiàn)為隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長，經(jīng)Hoechest33258染色的細(xì)胞核越來越多地表現(xiàn)出細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)在局部區(qū)域內(nèi)凝集，致密濃染，部分可見核碎裂，出現(xiàn)凋亡小體。該方法操作較為簡單，結(jié)果較為直觀，同時(shí)兼有可計(jì)數(shù)的優(yōu)點(diǎn)。在實(shí)際操作中我們發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)光線較為敏感，無論是配制染液還是觀察最好能在避光條件下進(jìn)行，以提高成像質(zhì)量。同時(shí)在操作中發(fā)現(xiàn)，封片的作用較為重要，若不及時(shí)封片，已染色的細(xì)胞十分容易淬滅，以致影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

流式細(xì)胞術(shù)是在功能水平上對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定量分析的手段，其具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)[12，13]。該方法可對(duì)細(xì)胞DNA含量進(jìn)行分析，將不易區(qū)分的細(xì)胞群體分為三個(gè)亞群 (G1期、G2期、S期)，可明確細(xì)胞所在的周期，同時(shí)可以計(jì)算出處于凋亡周期細(xì)胞的百分比[14，15]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度β咔啉類生物堿均對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞有抑制并凋亡作用，隨藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長，凋亡細(xì)胞比例增加。從而證實(shí)β咔啉類生物堿均對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞有抑制生長和誘導(dǎo)凋亡作用。為后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)。

綜上，在本次實(shí)驗(yàn)中，Hoechest33258細(xì)胞核染色法、MTT比色法、流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞活性的檢測基本一致，以上方法各具特點(diǎn)，相互補(bǔ)充?？筛鶕?jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求選擇不同的檢測方法。

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