劉 鐳，黃 亮，車清海，趙恩宏，黃 旭，程露陽，肖麗君

（1.承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學部免疫教研室，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤診治中心，河北 承德 067000；3.吉林市龍?zhí)秴^(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科 132000）

乳腺癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤，發(fā)病率已躍居國內(nèi)婦女癌癥發(fā)病首位［1］。X線片篩查受影像學特點的制約，使很多患者失去了早期發(fā)現(xiàn)的機會［2］。篩查腫瘤生物標記物對乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)具有重要意義，成為目前研究的主要焦點［3］。隨著生物數(shù)據(jù)的急劇增長和計算機技術(shù)的快速提高，生物信息學這一新興學科得到了前所未有的迅速發(fā)展，尤其是應(yīng)用生物信息學方法發(fā)現(xiàn)新基因和進行功能研究［4］。本文通過腫瘤基因組解剖計劃（cancer genome anatomy project，CGAP）基因表達系列分析（SAGE）數(shù)據(jù)庫，全面分析腫瘤組織基因表達譜，篩選新的乳腺癌高表達基因，并對其中一條功能未知的新基因FAM83A進行了初步的生物學分析，為進一步深入研究該基因的生物學功能及其參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞系MDA－MB－231和MCF－7來自承德醫(yī)學院中心實驗室。承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院收集5例乳腺癌手術(shù)切除標本（均經(jīng)術(shù)后病理證實），相應(yīng)的距癌灶邊緣2cm以外的癌旁組織，以及5例乳腺纖維瘤組織，各約100mg。標本裝入無菌管內(nèi)，迅速投入液氮罐內(nèi)冷凍。

1.2 方法

1.2.1 差異基因的篩選 利用CGAP提供的SAGE Genie數(shù)據(jù)庫，選取數(shù)字基因表達演示工具。選擇乳腺癌組織和乳腺良性腫瘤兩個池，設(shè)置F值為2，即表達差異大于2倍以上；Q為0.1。差異表達的基因按差異顯著性高低排序，比對出在短、長序列標簽文庫中都出現(xiàn)的差異基因。并對其中一條功能未知的高表達序列FAM83A進行初步的生物信息學分析。

1.2.2 序列比對 利用BLAST軟件檢索EST數(shù)據(jù)庫、nr數(shù)據(jù)庫及pro數(shù)據(jù)庫。將所克隆的基因核苷酸序列與GeneBank中已知核苷酸序列進行同源性分析。氨基酸序列相似性分析用NCBI／blastp，多序列比對和進化樹分析用clustal W。

1.2.3 理化性質(zhì)和亞細胞定位 對蛋白質(zhì)分子量、等電點、疏水性等理化性質(zhì)分析，用 ExPASy－protparam 工具。用PSORTⅡ服務(wù)程序進行亞細胞定位預測。

1.2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測 ELM預測蛋白質(zhì)功能性位點（http：／／elm.eu.org／）［5］。信號肽及剪切位點預測用 SignalIP。二級結(jié)構(gòu)預測應(yīng)用SOPMA工具。保守結(jié)構(gòu)域用NCBI／CDD預測。

1.2.5 電子表達譜分析 以FAM83A為關(guān)鍵詞，通過Uni－Gene庫中的EST表達情況分析獲得FAM83A基因電子表達譜。

1.2.6 半定量RT－PCR驗證性實驗 TRIZOL法提取乳腺癌細胞系、乳腺癌、癌旁、乳腺纖維瘤組織總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（QIAGEN）操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系25μL，其中包括2.5μL cDNA模板，2.5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液，0.5μL dNTP（10mmol／L），0.5μL Taq DNA 聚合酶，上下游引物各0.5μL。FAM83A 上游引物為：5′－TAG AGG CAG CCA ACA AGC GTG－3′；下游引物為：5′－CCT TTG GAA AGC TGG GCT TGG GAG－3′。反應(yīng)條件為94 ℃，15s；60℃，30s；72 ℃ 1min，30個循環(huán)。以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）作為反應(yīng)內(nèi)參。取10μL PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌高表達基因的篩選 最終篩選出33個在乳腺癌中高表達的基因，它們多數(shù)在Gene Bank中都被詳細注釋，并從中選取一條功能未知的明顯高表達的基因FAM83A。選擇短標簽序列搜索后結(jié)果顯示，在38個乳腺癌短序列標簽文庫中，有31個文庫具有FAM83A代表標簽（ATGTACAGGT），共出現(xiàn)1 575次。而在7個良性乳腺腫瘤短序列標簽文庫中，有2個文庫出現(xiàn)該代表標簽，表達差異為7.46倍。同時，在23個乳腺癌長序列標簽文庫中，有20個文庫具有FAM83A代表標簽（ATGTACAGGTTTGTAGC），共出現(xiàn)964次。而在5個良性乳腺腫瘤長序列標簽文庫中，只有一個文庫出現(xiàn)該代表標簽，表達差異為3.14倍。

2.2 FAM83A在GeneBank中的序列比對結(jié)果及不同剪接體組成 應(yīng)用BLAST工具比對，發(fā)現(xiàn)共有6條序列與FAM83A高度同源，多為人類新mRNA序列。其中發(fā)現(xiàn)兩條序列是FAM83A的轉(zhuǎn)錄變異體，GeneBank登錄號分別為NM＿207006.1和 NM＿032899.4，加上最初發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄變異體，F(xiàn)AM83A共有3個不同的剪接體。經(jīng)對FAM83A的多物種氨基酸序列相似性比較，人與長臂猿、小鼠、火雞和爪蟾的相似性分別為98%、87%、64%和41%，可見氨基酸組成在脊椎動物中保守性較高。各物種序列大小接近，起始氨基酸都是蛋氨酸?；贔AM83A多序列比對進化樹分析，人和長臂猿在進化上最為接近，在其他物種也有比較接近的進化來源。

2.3 理化性質(zhì)與亞細胞定位 FAM83A（AF497803）由367個氨基酸組成，生物軟件預測相對分子質(zhì)量為40 606，等電點為8.97。該蛋白質(zhì)的半衰期在人體網(wǎng)織紅細胞為30h；不穩(wěn)定指數(shù)為51.49（＞40考慮為不穩(wěn)定），分類為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪指數(shù)為77.06，平均疏水值為－0.346，是親水蛋白質(zhì)。根據(jù)軟件分析，預測該蛋白質(zhì)在線粒體中表達的可能性稍大（43.5%），其次分別是細胞核（34.8%）和細胞質(zhì)（21.7%）。

2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) ELM預測發(fā)現(xiàn)有PK、PKA等磷酸化位點，MAPK作用識別位點，SH2、SH3，RPEL和 WH2結(jié)合基序等，未發(fā)現(xiàn)有保守結(jié)構(gòu)域存在。未預測出信號肽剪切位點。SOPMA方法預測二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)FAM83A中α螺旋占43.5%，β折疊占5.72%，延伸鏈和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)分別占11.99%和48.5%。

2.5 FAM83A基因表達 電子表達譜分析顯示，F(xiàn)AM83A基因在部分正常組織和多種腫瘤中均有表達，見表1。

表1 FAM83A基因電子表達譜

2.6 FAM83A在乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中的表達 RTPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83A在乳腺癌細胞系 MDA－MB－231和MCF－7中均有表達（圖1A）。在5例乳腺癌組織中，3例FAM83A高表達；而在相應(yīng)的癌旁組織和乳腺纖維瘤中均不表達，見圖1B～C。

圖1 半定量RT－PCR檢測FAM83A基因的表達

3 討 論

乳腺是最常發(fā)生良、惡性腫瘤的器官，癌性增生與良性腫瘤有著本質(zhì)的不同，治療方案也完全不同［6］。所以，在篩選乳腺癌高表達基因時，臨床工作者希望尋找在癌組織中高表達，而在良性腫瘤組織中不表達或低表達的基因，對指導臨床的診斷和治療更具有意義。CGAP SAGE數(shù)據(jù)庫能夠全面分析腫瘤組織基因表達譜、尋找腫瘤特異性表達新基因［7］。在SAGE文庫中，本研究選擇了乳腺癌和良性乳腺腫瘤兩個池，提交后看到良性乳腺腫瘤池的文庫在短序列標簽中有7個，長序列標簽中有5個，主要是：乳腺纖維瘤、乳腺肌上皮瘤和良性乳腺間質(zhì)瘤，并最終篩選出乳腺癌高表達基因FAM83A。而且，半定量RT－PCR結(jié)果也進一步證實了生物信息學數(shù)據(jù)庫的可靠性。該基因在乳腺癌細胞系和多例乳腺癌組織中均高表達。

目前，F(xiàn)AM83A的研究很少，只是將該基因作為腫瘤生物學標記物用于外周血的檢測［8－9］，但關(guān)于該基因的功能少見文獻報道。ELM 分析提示，該蛋白質(zhì)具有 LIG＿14－3－3＿1，LIG＿14－3－3＿3蛋白質(zhì)配體，cylin底物識別位點和PK、PKA磷酸化位點等。14－3－3蛋白質(zhì)是真核生物中的一類保守蛋白質(zhì)家族，它們在細胞中發(fā)揮著信號轉(zhuǎn)導，細胞周期調(diào)控，凋亡和應(yīng)激反應(yīng)以及腫瘤惡性轉(zhuǎn)化等重要的作用，是蛋白質(zhì)間相互作用的媒介和調(diào)節(jié)者［10］。Cyclin底物識別位點在cyclin／CDK相互作用蛋白質(zhì)中被廣泛發(fā)現(xiàn)。該基序在CDK中的存在增加了（ST）Px（KR）基序的磷酸化水平。它通過cyclin蛋白質(zhì)中的保守區(qū)域被識別，并與p21Kip cyclin相似的方法結(jié)合［11］。PK和PKA磷酸化位點是信號傳導調(diào)控中的常見分子結(jié)構(gòu)，在細胞增殖及細胞周期中有著廣泛的調(diào)節(jié)作用［12］。

以上分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)在進化上保守，從低等到高等動物都有相似蛋白質(zhì)的表達，是不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，可能定位于線粒體上，有著多個功能位點和基序，提示參與信號轉(zhuǎn)導和細胞周期調(diào)控。特別要提出的是，該基因存在多個轉(zhuǎn)錄變異體，表明它在生物體發(fā)育過程中的細胞增殖和凋亡的調(diào)控方面起著重要的作用。該基因在乳腺癌中的高表達具有顯著意義，很可能是通過使細胞持續(xù)增生，控制凋亡和改變細胞周期而發(fā)揮作用的。

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