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        TNF-α對腎血管收縮敏感性的影響

        2013-08-24 11:53:08郭蓮怡王桂君
        關(guān)鍵詞:離體灌流水腫

        郭蓮怡,王桂君,史 璇

        遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 消化科,遼寧錦州 121001

        肝腎綜合征(hepatorenal syndrome,HRS)是由于嚴(yán)重的肝功能損害及門脈高壓所致的急性功能性腎衰竭,是終末期肝病常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,腎血管收縮是HRS的主要原因。有研究表明肝硬化時腎臟對縮血管物質(zhì)的敏感性增強(qiáng)[1]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)作為重癥肝炎發(fā)生的重要因子[2],與重癥感染時腎衰的發(fā)生發(fā)展明顯相關(guān)[3]。然而,TNF-α在HRS腎血管收縮中的作用及機(jī)制目前還不清楚。本研究應(yīng)用離體灌注腎技術(shù)觀察TNF-α預(yù)灌流離體大鼠腎臟后,腎血管對內(nèi)皮素(endothelin,ET)收縮反應(yīng)性的改變。

        材料和方法

        1 實(shí)驗(yàn)動物 選擇清潔級雄性SD大鼠28只,體質(zhì)量250~300 g。(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供,許可證號:SCXK(遼)2003-0007,開放系統(tǒng)飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)前禁食12 h)。

        2 主要試劑和儀器 TNF-α(Sigma公司)、ET-1(Sigma公司)、2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB,Sigma公司)、無鈣Kreb's灌流液。Minipuls2灌注泵,法國Gilson;RM6000多導(dǎo)生理記錄儀,日本;恒溫灌注池,廣東;Oxnard CA張力換能器,美國Gould;氧合器,熱交換器、HTG恒溫器,上海;倒置顯微鏡,德國Carl Zeiss公司。

        3 離體灌注腎實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷慕4]應(yīng)用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經(jīng)腹腔注射將大鼠麻醉。剪毛,腹壁消毒,正中切開,用棉簽分離腸系膜上動脈、右腎動脈、右腎靜脈及右側(cè)輸尿管。用套管針從腸系膜上動脈插管,經(jīng)腹主動脈,插入右腎動脈起始部,管外接三通,三通接張力換能器和灌注裝置,腎靜脈開放。在腸系膜上動脈及右腎動脈主干分別結(jié)扎。整個手術(shù)過程均在10 min左右完成。左腎取出稱重作為對照腎重。灌注過程:在腹主動脈插管至腎動脈時啟動灌注泵,開始灌流。灌注液流量恒定為5 ml/min,經(jīng)熱交換器加溫至37℃,經(jīng)氧合器持續(xù)給95%氧和5%二氧化碳的混合氣,灌流液為一次性,不再循環(huán)應(yīng)用。

        4 實(shí)驗(yàn)分組 28只大鼠制備離體灌注腎模型后隨機(jī)分為4組(n=7),平衡期后(開始灌流5~10 min后,繼續(xù)穩(wěn)定20 min,共30 min),進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。具體分組:A1組(n=7):平衡期后,無鈣Kreb's液灌流90 min,加ET(1 nmol/L)刺激;A2組(n=7):平衡期后,用含TNF-α(100 μg/L)的無鈣Kreb's液灌流90 min,加ET(1 nmol/L)刺激;B1組(n=7):平衡期后,用無鈣Kreb's液灌流90 min(其中后10 min加入30 μmol/L的2-APB),加ET(1 nmol/L)刺激;B2組(n=7):平衡期后,用含TNF-α(100 μg/L)的無鈣Kreb's液灌流90 min(其中后10 min加入30 μmol/L的2-APB),加ET(1 nmol/L)刺激。

        5 離體腎體外灌注過程 整個實(shí)驗(yàn)過程由多導(dǎo)生理記錄儀連續(xù)記錄腎臟灌注壓。實(shí)驗(yàn)過程分三個階段:第一階段(平衡期):4組在灌流通路上,均先用無鈣Kreb's液灌流30 min,以達(dá)到平衡;第二階段(灌流期):各組分別用含特定成分的無鈣Kreb's液灌流90 min;第三階段(刺激期):各組均予含ET(1 nmol/L)的無鈣Kreb's液繼續(xù)灌流20 min。據(jù)報道離體腎體外灌流140 min內(nèi)血流動力學(xué)穩(wěn)定[4],故整個灌流過程持續(xù)時間為140 min。

        6 腎臟水腫率及病理檢查 灌流結(jié)束后,各組腎標(biāo)本稱重,計(jì)算腎臟水腫率,腎臟水腫率=(灌流后腎重-對照腎重)/對照腎重。4%的多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋、HE染色觀察腎小球及腎小管形態(tài)、結(jié)構(gòu)。

        7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料(即各組灌注壓值)以-x±s表示,各組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 對基礎(chǔ)灌注壓的影響 平衡期過后,各組基礎(chǔ)灌注壓比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。TNF-α、2-APB預(yù)灌流時,基礎(chǔ)灌注壓無明顯改變。

        2 TNF-α對ET縮血管作用的影響 A1、A2組在應(yīng)用ET(1 nmol/L)刺激后,腎灌注壓較基礎(chǔ)壓均明顯升高(P<0.05);A2組灌注壓升高值顯著高于A1組(P<0.01)。見圖1,表1。

        圖 1 TNF-α對ET縮血管作用的影響Fig. 1 Effect of TNF-α on renal vasoconstriction by ET

        3 阻斷IP3R對TNF-α作用的影響 B1、B2組于灌流后期加入2-APB,刺激期用ET(1 nmol/L)刺激,腎灌注壓均略升高,但與基礎(chǔ)灌注壓比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);兩組灌注壓升高值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖2,表1。

        表1 各組大鼠離體腎灌注壓水平Tab. 1 Renal perfusion pressure of each group(mmHg, -x±s, n=7)

        4 腎臟水腫率及病理變化 4組腎臟的水腫率分別為28%±2%、29%±3%、28%±3%、27%±2%,且灌流后的腎臟標(biāo)本切片經(jīng)HE染色均未發(fā)現(xiàn)明顯的器質(zhì)性損傷,與灌流前相符。見圖3。

        討 論

        重型肝炎和各種原因引起的肝硬化常并發(fā)多臟器功能衰竭,尤其當(dāng)并發(fā)HRS時,患者的預(yù)后極差,80%~100%的患者在診斷后的1個月內(nèi)死亡。HRS不同于原發(fā)性腎臟疾病的腎衰竭,它缺乏后者所具有的臨床、實(shí)驗(yàn)室和組織學(xué)的改變,目前認(rèn)為HRS的發(fā)生是由于腎血管收縮造成腎臟明顯低灌流的結(jié)果,其機(jī)制尚不完全清楚。當(dāng)HRS發(fā)生時,患者血清中許多縮血管活性物質(zhì)水平明顯增高,并可直接或通過間接途徑引起腎血管收縮,是導(dǎo)致腎血流灌注和腎功能紊亂的重要介質(zhì)[1]。近年來學(xué)者們認(rèn)為:重型肝炎患者血中高濃度的TNF-α是引起多臟器功能衰竭發(fā)生的重要因子[2],許多研究表明TNF-α可通過多種途徑引起血管收縮,從而參與相關(guān)疾病的病理生理過程:1)TNF-α可通過TNFR2和ET-ETR依賴途徑引起血管收縮。TNF-α可通過引起ET產(chǎn)生增多來發(fā)揮縮血管作用。當(dāng)阻斷ETA、、ETB受體后,TNF-α就不再有縮血管作用了[5]。2)TNF-α抑制內(nèi)皮依賴的一氧化氮-環(huán)磷酸鳥苷(NO-CGMP)途徑導(dǎo)致血管收縮。首先TNF-α通過活化蛋白激酶C(PKC)抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化從而抑制eNOS的活性;同時TNF-α可通過縮短eNOS mRNA的半衰期來下調(diào)eNOS mRNA[6]。3)TNF-α可增強(qiáng)Ca2+依賴及非Ca2+依賴蛋白激酶活性,增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞收縮[7]。

        本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):腎臟經(jīng)含TNF-α的無鈣Kreb's液灌流后,其腎血管對ET的反應(yīng)提高,表現(xiàn)為腎血管灌注壓明顯高于非TNF-α處理組。結(jié)果顯示:TNF-α可增強(qiáng)ET引起的腎血管收縮。

        腎血流量受血管平滑肌的收縮和舒張調(diào)節(jié),而血管平滑肌的收縮和舒張又受平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加受兩個作用機(jī)制來調(diào)控[8]:一方面胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi):各種刺激,如膜電壓改變、受體結(jié)合、第二信使及機(jī)械刺激都可以使細(xì)胞膜上的Ca2+通道開放,引起胞外Ca2+大量內(nèi)流;另一方面胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+:各種刺激使肌漿網(wǎng)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))膜上的鈣釋放通道開放,引起細(xì)胞內(nèi)儲備Ca2+的釋放。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用無鈣Kreb's液灌流腎臟,不存在胞外Ca2+內(nèi)流這一因素,因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明:TNF-α可通過促進(jìn)胞內(nèi)鈣釋放進(jìn)而增強(qiáng)ET的腎血管收縮作用。

        已知ET等血管活性物質(zhì)與靶細(xì)胞膜上特異性受體(如ET受體)結(jié)合后,使膜磷脂酰肌醇4,5-二磷酸發(fā)生磷酸化生成IP3,IP3與IP3R(胞內(nèi)主要的Ca2+釋放通道)結(jié)合則促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放,使胞內(nèi)Ca2+水平增高[9],引起細(xì)胞收縮。2-APB是一種常用的IP3R的阻斷劑,可特異性阻斷IP3R[10],本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用含2-APB及TNF-α的無鈣Kreb's液灌流腎臟,其腎血管對ET的反應(yīng)較差,ET刺激后的腎血管灌注壓無顯著變化。結(jié)果表明:2-APB可阻斷TNF-α的前述作用,說明TNF-α可能通過上調(diào)IP3R進(jìn)而增強(qiáng)ET引起的腎血管收縮。

        已有研究報道:TNF-α可誘導(dǎo)腎小球纖維蛋白沉積、中性粒細(xì)胞浸潤、細(xì)胞凋亡,引起GFR下降。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,所有的腎臟標(biāo)本稱重,計(jì)算其水腫率<30%,說明灌流成功;并進(jìn)行常規(guī)病理檢查均未發(fā)現(xiàn)腎小管及腎小球細(xì)胞病理性改變,故排除了實(shí)驗(yàn)結(jié)果受器質(zhì)性腎臟損傷影響的因素[11]。

        綜上所述,重癥肝炎患者血中存在的高濃度TNF-α可能上調(diào)IP3R,促進(jìn)胞內(nèi)鈣釋放,誘導(dǎo)腎入球動脈平滑肌收縮性增強(qiáng),腎入球動脈收縮,造成腎血流減少,參與HRS發(fā)生。

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