李 明，劉 霞，郭書(shū)翰，董 玫，杜正倫，高鵬志，宋鐵鷹，史清文石家莊市第一醫(yī)院， 河北石家莊 0500； 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 05007

近年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提高，原位乳腺癌患者生存期明顯延長(zhǎng)，但當(dāng)乳腺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后，尤其腦轉(zhuǎn)移患者預(yù)后最差[1]，且據(jù)統(tǒng)計(jì)，腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率呈增加趨勢(shì)[2]。由于目前醫(yī)學(xué)界尚缺乏特效藥物降低腫瘤轉(zhuǎn)移率、延長(zhǎng)患者生存期，因此開(kāi)發(fā)可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、不良反應(yīng)小、價(jià)格低廉的天然植物藥物一直是當(dāng)前醫(yī)藥學(xué)界研究的熱點(diǎn)。楝科植物木果楝(xylocarpus granatum)是一種生長(zhǎng)在熱帶沿海地帶的紅樹(shù)林植物，在我國(guó)主要生長(zhǎng)于海南地區(qū)，民間用其樹(shù)皮治療赤痢，種仁用作滋補(bǔ)品[3-4]。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)木果楝中的植物化合物成分具有抗宮頸癌及肺癌作用[5]。本研究首次檢測(cè)了三種木果楝內(nèi)酯抑制人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移(KT)細(xì)胞增殖的效應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)變化，探討木果楝內(nèi)酯抑制人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

材料和方法

1 主要材料 三種木果楝內(nèi)酯化合物Xylogranatin C[6]、Xylocarpin H[7]和Xylomexicanin A[8]由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室從木果楝種子中純化提供，經(jīng)1H-NMR檢查，純度在99%以上(圖1)；KT細(xì)胞由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二生物化學(xué)教室提供，細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)，GIBCO)；噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Sigma公司，M-2128)；順鉑(Cisplatin，美國(guó)Sigma，034k3693)；鼠抗Bax多克隆抗體(sc-7480)、鼠抗p53多克隆抗體(sc-1615-R)以及二抗(sc-2056，sc-2054)均為SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY產(chǎn)品；兔抗Caspases-3多克隆抗體(2305-PC-020；Trevigen，MD，USA)，caspase抑制劑Z-VAD-FMK(Promega，USA)。

圖 1 木果楝內(nèi)酯化合物Xylogranatin C (1)、 Xylocarpin H (2)和Xylomexicanin A (3)的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of xylogranatins C (1), H (2) and A (3)

2 MTT法檢測(cè)木果楝內(nèi)酯化合物抑制KT細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KT細(xì)胞，0.125%胰酶消化，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔含1×104個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組為：溶劑對(duì)照組(含終濃度0.1% DMSO)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑及木果楝內(nèi)酯化合物Xylogranatin C、Xylocarpin H和Xylomexicanin A。后5組中藥物終濃度分別設(shè)為1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L；上述實(shí)驗(yàn)各組藥物均用終濃度0.1% DMSO溶解。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于飽和濕度、37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入5 mg/ml四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)10 μl，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞生存率，細(xì)胞生存率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 7.0軟件進(jìn)行處理，受試藥物對(duì)細(xì)胞增殖活性的濃度-效應(yīng)曲線用Hill數(shù)學(xué)模型擬合，計(jì)算藥物的IC50值。

3 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化將KT細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60%~70%，分別加入終濃度為10 μmol/L的5-氟尿嘧啶、順鉑和Xylogranatin C的含0.1% DMSO的1640培養(yǎng)基，溶劑對(duì)照組加入終濃度為0.1% DMSO的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞24 h，用PBS洗滌細(xì)胞后，胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰浴下超聲波處理5 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，100 ℃加熱3 min使蛋白質(zhì)變性，取50 μg蛋白在SDSPAGE電泳下分離，分離膠為12%，濃縮膠為5%。根據(jù)預(yù)染的蛋白Marker指示，小心割取目標(biāo)蛋白所在的區(qū)帶，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉于室溫下?lián)u動(dòng)封閉1 h。Caspases-3兔多克隆抗體(1∶800)、Bax鼠多克隆抗體(1∶1 000)、p53鼠多克隆抗體(1∶1 000)稀釋液封閉4 °過(guò)夜，1×TBS洗膜15 min，3次，二抗稀釋液(抗鼠1∶20 000，抗兔1∶20 000)孵育20 min，再次洗膜后加入ECL試劑，反應(yīng)5 min，用X線片曝光1~10 min后，顯影。

4 Caspase抑制劑在木果楝內(nèi)酯化合物抑制人KT細(xì)胞增殖中作用 MTT方法同前，96孔培養(yǎng)板，每孔含1×104個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為：溶劑對(duì)照組、終濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的Xylogranatin C組，20 μmol/L的Caspase抑制劑Z-VAD-FMK與1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L Xylogranatin C共同孵育組，細(xì)胞生存率計(jì)算方法同前，比較給予Z-VAD-FMK前后KT細(xì)胞的生存率變化。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用-x±s表示；兩組間數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析。應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

1 三種木果楝內(nèi)酯化合物對(duì)KT細(xì)胞增殖抑制作用MTT結(jié)果顯示：與溶劑對(duì)照組(生長(zhǎng)率為100%)相比，順鉑對(duì)KT細(xì)胞的增殖顯示了較強(qiáng)的抑制活性，IC50為6.61 μmol/L；Xylogranatin C對(duì)KT細(xì)胞的增殖亦顯示了較強(qiáng)的抑制作用，IC50為5.09 μmol/L，并呈現(xiàn)劑量依賴性；且10 μmol/L Xylogranatin C與順鉑相比具有相同的抑制作用，兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；5-FU以及Xylocarpin H和Xylomexicanin A對(duì)KT增殖顯示較弱或不顯示抑制活性。見(jiàn)圖2。

圖 2 三種木果楝內(nèi)酯化合物對(duì)KT細(xì)胞增殖的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effects of xylogranatins C, H and A on proliferation of KT cells

2 Xylogranatin C對(duì)KT細(xì)胞p53、Bax和Caspaes-3的上調(diào)作用 Weston結(jié)果顯示：Xylogranatin C作用KT細(xì)胞后，可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53、Bax和Caspaes-3蛋白的表達(dá)，與溶劑對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；順鉑作用KT細(xì)胞后，顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的Bax和Caspaes-3蛋白表達(dá)，與溶劑對(duì)照組相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；Xylogranatin C組與順鉑組比較，Bax和Caspaes-3的蛋白表達(dá)低于順鉑組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

圖 3 Xylogranatin C(10 μmol/L)對(duì)KT細(xì)胞增殖作用的分子機(jī)制Fig. 3 Molecular mechanism of xylogranatin C (10 μmol/L)underlying proliferation of KT cells

3 Caspase抑制劑減弱了Xylogranatin C的細(xì)胞毒性作用 使用1μmol/L、10μmol/L和100 μmol/L的Xylogranatin C處理KT細(xì)胞，KT細(xì)胞生存率分別為71.97%、39.91%和11.15%；使用20 μmol/L的Caspase抑制劑Z-VAD-FMK與1μmol/L、10μmol/L和100 μmol/L Xylogra-natin C共同孵育KT細(xì)胞后，細(xì)胞生存率分別上升為82.78%、46.27%和30.99%。見(jiàn)圖4。

圖 4 Z-VAD-FMK減弱Xylogranatin C對(duì)KT細(xì)胞增殖的作用Fig. 4 Role of Z-VAD-FMK in reversing the inhibitory effect of xylogranatin C on KT cells

討 論

乳腺癌患者預(yù)后與其是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，一旦發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，如腦轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移等預(yù)后較差，生存期明顯下降，增加了臨床治療的困難[9]。此外，以腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為首發(fā)癥狀的隱性乳腺癌的發(fā)生呈增加趨勢(shì)[10]，目前針對(duì)乳腺癌，除手術(shù)切除原發(fā)灶外，化療、內(nèi)分泌治療及分子靶向治療相結(jié)合在乳腺癌遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注[11-12]，但尋找高效低毒、價(jià)格低廉的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的天然植物藥物仍是目前醫(yī)藥學(xué)界一直研究的熱點(diǎn)，具有一定的臨床應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)從楝科植物木果楝種子中提純的木果楝內(nèi)酯Xylogranatin C化合物具有較強(qiáng)抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性的能力[13]，其是否具有抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖作用尚未研究。

本實(shí)驗(yàn)首次選用從楝科植物木果楝種子中純化的三種木果楝內(nèi)酯Xylocarpin H、Xylogranatin C和Xylomexicanin A為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察了三種木果楝內(nèi)酯對(duì)人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞增殖的抑制活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Xylogranatin C對(duì)KT細(xì)胞增殖顯示較強(qiáng)的抑制活性，且與順鉑作用相當(dāng)，而5-FU對(duì)KT細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯。

在探究藥物抗腫瘤細(xì)胞的機(jī)制方面，能否引起腫瘤細(xì)胞凋亡已成為評(píng)價(jià)抗癌藥物的一項(xiàng)重要指標(biāo)[14]。目前已知多條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，Caspase 3被認(rèn)為是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶；Bax是另一種促進(jìn)凋亡因子，Bcl-2/Bax鑲嵌在線粒體膜上，調(diào)控凋亡誘導(dǎo)蛋白的釋放和線粒體功能；此外，p53對(duì)誘導(dǎo)和執(zhí)行細(xì)胞死亡起重要作用[15]，p53非轉(zhuǎn)錄依賴性凋亡調(diào)控功能依賴于p53蛋白與Bcl-2蛋白超家族成員(Bak，Bax，Bcl-2)間的相互作用。因此本實(shí)驗(yàn)觀察了與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白因子p53、Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Xylogranatin C可明顯誘導(dǎo)KT細(xì)胞內(nèi)的p53、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，表明Xylogranatin C通過(guò)誘導(dǎo)KT細(xì)胞凋亡抑制了腫瘤細(xì)胞增殖。使用Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可以減弱Xylogranatin C的細(xì)胞毒性作用，提示Xylogranatin C可能通過(guò)激活Caspase通路誘導(dǎo)KT細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

本實(shí)驗(yàn)初步研究了木果楝內(nèi)酯化合物抑制人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，限于體外實(shí)驗(yàn)的局限性，Xylogranatin C是否能夠應(yīng)用于整體實(shí)驗(yàn)抑制腫瘤增殖，以及其抗腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究和完善。

1 苗培田，佟仲生，郝春芳，等．不同亞型轉(zhuǎn)移性乳腺癌轉(zhuǎn)移特點(diǎn)及預(yù)后分析［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2011，38（4）：228-231．

2 李艷，王丕琳，宋茂民，等．乳腺癌腦轉(zhuǎn)移治療的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)癌癥雜志，2009，19（4）：313-317．

3 林鵬，林益明，楊志偉，等．中國(guó)海洋紅樹(shù)林藥物的研究現(xiàn)狀、民間利用及展望［J］.海洋科學(xué)，2005，29（9）：76-79．

4 Yin S， Wang XN， Fan CQ， et al. Limonoids from the seeds of the Marine mangrove Xylocarpus granatum［J］ . J Nat Prod， 2007， 70（4）： 682-685.

5 戴好富，梅文莉，曾艷波，等．紅樹(shù)林植物木果楝細(xì)胞毒活性和化學(xué)成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2007，19（1）：74-76．

6 Yin S， Fan CQ， Wang XN， et al. Xylogranatins A-D： novel tetranortriterpenoids with an unusual 9，10-seco scaffold from Marine mangrove xylocarpus granatum［J］. Org Lett， 2006， 8（21）：4935-4938.

7 Shen LR， Dong M， Guo D， et al. Xylomexicanins A and B， new Delta14，15-mexicanolides from seeds of the Chinese mangrove Xylocarpus granatum［J］. Z Naturforsch C， 2009， 64（1-2）：37-42.

8 王思明，王溪，蘇曉會(huì)，等. 續(xù)隨子中千金二萜烷化合物抑制人婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性的研究［J］. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（6）：774-776.

9 靳鵬，謝曉冬，劉兆喆，等. 異黏蛋白在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌表達(dá)及其臨床意義的研究［J］. 解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，34（2）：133-136.

10 李捷，張艷君，王建東，等．以腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為首發(fā)癥狀的隱性乳腺癌診治分析［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32（5）：418-419，482．

11 張帆，楊俊蘭．乳腺癌靶向治療進(jìn)展［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30（5）：757-758．

12 尉承澤，江澤飛．乳腺癌治療基本原則和臨床選擇［J］.中國(guó)實(shí)用外科雜志，2009，29（ 09）：774-776．

13 常和平，王思明，霍長(zhǎng)虹，等．木果楝內(nèi)酯化合物抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性及作用機(jī)制的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（6）：807-810．

14 Kerr JF， Winterford CM， Harmon BV. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy［J］. Cancer， 1994， 73（8）：2013-2026.

15 許薇薇，黃一飛．放射線導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的分子生物學(xué)機(jī)制［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（3）：304-306．