關 杰，任軍偉，朱 遠，傅淑宏，白 潔，鄧新立，叢玉隆

解放軍總醫(yī)院 南樓檢驗科，北京 100853

抗血小板治療是心血管病患者重要的治療方法，由于其治療后仍存在出血或再次血栓的問題，臨床實驗室可以通過血小板功能監(jiān)測患者治療情況。血小板功能檢測有諸多方法，許多文獻對不同檢測方法與臨床預后的關系作了評價，其中，光學比濁法(light transmittance aggregometry，LTA)是受到廣泛認可，甚至被認為是“金標準”的血小板功能檢測方法，但存在如操作繁雜、質量控制難等問題[1-2]。血小板功能檢測儀PL-11應用的連續(xù)血小板計數(shù)法，是以庫爾特原理為基礎的新型血小板功能檢測方法，通過觀察誘聚劑引起血小板聚集前后全血中血小板數(shù)量的改變來評估血小板功能。目前對于它的研究較少。本研究比較LTA與PL-11連續(xù)血小板計數(shù)方法對血小板功能的監(jiān)測，評價PL-11連續(xù)血小板計數(shù)法與LTA的相關性及其監(jiān)測血小板功能的價值。

對象和方法

1 對象 實驗組選擇本院2012年經(jīng)血管造影確診為冠脈疾病(coronary artery disease，CAD)的患者26例，且目前僅以氯吡格雷作為抗血小板藥物，服藥時間＞1個月。其中男性19例，女性7例，平均年齡(76.81±2.13)歲；排除使用其他影響血小板功能的藥物(如阿司匹林，非甾體類抗炎藥，噻氯匹定，雙嘧達莫)、處于缺血性血管事件中或有出血性疾病的患者。另征集45例本院健康成年受試者為對照組，其中男33名，女12名，平均年齡(23.53±1.84)歲；排除患有任何慢性或者急性疾病、正在服用已知對血小板功能有影響的藥物(包括非甾體類抗炎藥)、吸煙或懷孕者。所有受試者對于本課題均知情同意。

2 儀器與試劑 CRONO-LOG Model 700血小板聚集儀(美國CHRONO-LOG公司)及配套試劑(ADP，濃度1 mmol/L)；PL-11血小板功能分析儀(南京神州英諾華醫(yī)療科技有限公司)及配套試劑(ADP，濃度50 mmol/L)；真空采血管為美國B.D.公司的含3.2%枸櫞酸鹽抗凝管。

3 標本采集 均于清晨使用3.2%枸櫞酸鹽抗凝真空管采集受試者肘靜脈血：3管/人，其中1管用于PL-11檢測，2管用于LTA檢測。標本保存于37 ℃恒溫箱，2 h內完成檢測；檢測前不能出現(xiàn)凝集。

4 血小板聚集實驗(LTA) 兩管枸櫞酸鹽抗凝血分別經(jīng)800 r/min、5 min和4 000 r/min、8 min得到富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)和乏血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)后各取500 μl加至比色杯。使用CRONO-LOG血小板聚集儀檢測，以PPP為空白參照，5 μl濃度為1 mmol/L的ADP為誘聚劑加入至PRP(ADP最終濃度：10 μmmol/L)，PRP中透光度改變最大時得到血小板最大聚集率(max aggregation ratio，MAR)，以百分數(shù)表示。

5 PL-11連續(xù)血小板計數(shù)法 使用移液器吸取0.5 ml枸櫞酸鹽抗凝全血至PL-11檢測試管并開始自動檢測。全血標本經(jīng)兩次血小板基礎值計數(shù)后，儀器自動加入40 μl濃度為50 mmol/L誘聚劑ADP(全血中最終濃度：4 mmol/L)，并連續(xù)間隔一定時間對血標本中血小板計數(shù)，當?shù)玫阶畹脱“逵嫈?shù)時結果自動換算，以最大血小板聚集率表示，即{(初始血小板數(shù)－最低血小板數(shù))÷初始血小板數(shù)}×100%。

6 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計軟件使用SPSS13.0進行分析，連續(xù)變量采用-x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，兩組結果相關性采用Pearson線性相關分析，多組間定量資料比較采用方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。繪圖軟件使用Prism 5 for Window version 5.01。

結 果

1 兩種方法檢測血小板聚集率比較 經(jīng)獨立樣本t檢驗顯示，LTA、PL-11分別檢測健康志愿者和服藥患者時，結果均有統(tǒng)計學差異(P＜0.000 1)；兩種方法健康志愿者血小板聚集率值均大于服藥患者組(表1)。在兩組受試者中，LTA所檢測的最大血小板聚集率范圍高于PL-11，見圖1。

表1 兩種方法檢測最大血小板聚集率比較Tab. 1 MAR detected by LTA and continuous platelet count with PL-11(%)

圖 1 實驗組與對照組兩種方法檢測結果Fig. 1 MAR detected by LTA and continuous platelet count with PL-11 in CAD patients and volunteers

2 兩種方法相關性分析 所有受試者中PL-11與LTA結果MAR存在明顯相關( r=0.766，P＜0.000 1)(圖2A)；在服藥患者組中，PL-11與LTA結果存在較好的相關性( r=0.616，P＜0.001)(圖2B)；在健康志愿者結果中，未發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法存在相關性( r=0.250，P=0.098)。

3 PL-11檢測平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)的變化 結果顯示，兩組受試者全血標本中加入誘聚劑ADP引起血小板聚集后，最大血小板聚集率主要出現(xiàn)在第3~5檢測點，MPV值也在第3點后出現(xiàn)最大值，二者變化趨勢一致。未發(fā)現(xiàn)健康者與患者初始MPV值的差異(P=0.321)；分別對兩組受試者前6個檢測點MPV進行方差分析時(圖3)，第1、2個測試點間無統(tǒng)計學差異(P=0.998)，第3個測試點與第1、2個測試點間有統(tǒng)計學差異(P值均＜0.000 1)，與第4、5、6測試點間差異無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.969，0.791，0.977)。

圖 2 PL-11與LTA相關性分析 A：所有受試者B：服藥患者組Fig. 2 Correlation between continuous platelet count with PL-11 and LTA in all subjects (A) and CAD patients (B)

圖 3 PL-11檢測血小板聚集時MPV變化 A：服藥患者組B：健康志愿者組Fig. 3 MPV detected by continuous platelet count with PL-11 in CAD patients (A) and volunteers (B)

討 論

自1962年血小板聚集功能的概念提出及20世紀80年代末英國血液學標準委員會(British com-mittee for Standards in Haematology，BCSH)提出血小板功能檢測方法指南后，許多實驗室檢測方法問世，其中最常用方法是LTA，被認為是血小板功能檢測“金標準”。盡管存在一些技術缺陷，仍有許多研究報道LTA檢測結果與臨床不良事件之間存在聯(lián)系[3-7]。

本文通過PL-11與LTA檢測健康人群及服用氯吡格雷患者經(jīng)ADP誘導后血小板聚集功能變化，對兩種方法進行評價，證實PL-11連續(xù)血小板計數(shù)法對全血標本檢測與“金標準”的LTA方法在檢測血小板聚集功能時具有較好的相關性。由于兩種檢測方法均為體外檢測，受到采血、保存等因素的影響，二者檢測結果最大血小板聚集率在正常范圍內微幅波動，因此在健康人群中未見二者結果的相關性。

研究結果中LTA結果在健康人與服藥患者組具有統(tǒng)計學差異，證實其能夠反映血小板功能及監(jiān)測服藥后血小板功能改變，與之前文獻結果一致[8-9]。PL-11連續(xù)血小板計數(shù)法同樣能檢測到兩組受試者間差異。有文獻報道，同樣以血小板計數(shù)方法為基礎的Plateletworks儀器檢測到服用氯吡格雷后患者最大血小板聚集率也明顯降低[10]。當以ADP為誘聚劑時，Van Werkum等[11]對CAD患者進行檢測，Plateletworks與LTA之間結果存在較好相關( r=0.71，P＜0.000 1)，與本研究結果相近( r=0.766)。該作者認為，通過血小板計數(shù)檢測血小板聚集功能有時間依賴性，當檢測時間＞10 min時結果偏低。事實上，加入ADP誘聚后，PL-11連續(xù)進行血小板計數(shù)，在第3~5個測試點達到最大聚集率，時間為6~10 min，即血小板計數(shù)呈現(xiàn)先急劇減少而后緩慢增加的狀態(tài)，故10 min后結果偏低。這種現(xiàn)象同樣發(fā)生在LTA檢測中，透光強度急劇達到最大時又逐漸減小。這種現(xiàn)象可能與ADP濃度有關，因為本試驗中所使用ADP濃度較低，有資料顯示，較低濃度的ADP刺激血小板聚集后易發(fā)生解聚，若提高濃度，可能使情況發(fā)生改變[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論在健康人或服藥患者中，LTA檢測結果范圍均高于PL-11。實際上LTA是誘聚劑刺激后，血小板與纖維蛋白原結合產(chǎn)生光學變化后的反映，而PL-11檢測的是經(jīng)庫爾特原理設定參數(shù)范圍內認為是血小板的較小顆粒(血小板直徑2~30 μm)，較LTA對小顆粒更敏感，故出現(xiàn)該現(xiàn)象。由此引起的問題可能是當LTA測得最大血小板聚集率處于0~100%中間水平與較低水平時，PL-11結果變化較小，反映血小板功能較小差異時不明顯。不同檢測標本可能也是帶來這種差異的原因，因為在PRP中可能存在由于離心從細胞中釋放出繼續(xù)引起血小板聚集的物質[13]。這種推論需要進一步驗證。

MPV被認為是血小板活性的標記物之一，增大的MPV提示血小板活性增強[14]。PL-11在連續(xù)計數(shù)血小板時，提供每個測試點的血小板MPV值，檢測結果中聚集后剩余血小板體積增加(其原因可能是兩個或者多個較小的血小板聚集成大血小板聚集顆粒引起)，為明確其活化聚集提供了依據(jù)。

綜上所述，PL-11連續(xù)血小板計數(shù)法與光學比濁法在檢測血小板聚集功能時有較好的相關性，較全面地提供了最大血小板聚集率、血小板計數(shù)、MPV變化情況，是一種可以供臨床實驗室選擇的血小板功能檢測方法。

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