尹燕敏

（蘇州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，江蘇蘇州 215004）

20世紀(jì)60年代，抗生素開始用作畜禽飼料添加劑。近年來隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，為了治療、預(yù)防動(dòng)物疾病和促進(jìn)其機(jī)體生長，相當(dāng)一部分飼養(yǎng)者違規(guī)超量使用抗生素?？股貫E用導(dǎo)致環(huán)境中抗生素殘留已成為一個(gè)嚴(yán)重的生態(tài)問題［1-2］?？股亟?jīng)使用后，相當(dāng)一部分以原物或代謝物的方式隨糞便排出?？股卮蠖酁闃O性化合物，具有親水、揮發(fā)性弱等特征，因而水體是抗生素類污染最重要的“匯”。目前已從地下水、河水、城市污水等多種環(huán)境水體中檢出抗生素［3-4］。

分屬于四環(huán)素類的四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）及分屬于大環(huán)內(nèi)酯類的羅紅霉素（ROX）是常用的抗生素類藥物。目前，測(cè)定上述抗生素殘留檢測(cè)方法很多，大致分為3類，一是生物測(cè)定法，包括微生物測(cè)定法（microbiological assay）、放射受體測(cè)定法（redio receptor assay）等；二是儀器分析法，包括波譜分析、紫外分析、熒光分析、高效液相色譜分析、氣相色譜分析、液質(zhì)聯(lián)用分析等；三是免疫分析法，包括酶聯(lián)免疫測(cè)定法（EIA，ELISA）、膠體金免疫層析法等［5-9］。其中測(cè)定四環(huán)素、土霉素及羅紅霉素多用微生物法、酶聯(lián)免疫法和液相色譜法，但這些方法存在特異性差、靈敏度低等缺點(diǎn)。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法選擇性高，特異性好，靈敏度高，且能最大程度地避免假陽性［10-12］。筆者利用固相萃取（SPE）濃縮凈化，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析技術(shù)，采用外標(biāo)法建立了同時(shí)檢測(cè)地表水及城市污水中四環(huán)素、土霉素及羅紅霉素殘留的方法，測(cè)量精密度、準(zhǔn)確度符合要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：UPLC-XEVO-TQMS型，美國Waters公司；

全自動(dòng)固相萃取儀：6位Caliper Autotrace SPE，美國Caliper公司；

氮吹儀：EYELA MG-2200型，日本EYELA公司；

乙腈、甲醇：均為色譜純，美國Merck公司；

甲酸：色譜純，美國Tedia公司；

氫氧化鈉、硫酸：均為優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

Na2EDTA：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

四環(huán)素、鹽酸土霉素、羅紅霉素色譜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水或去離子水。

1.2 儀器工作參數(shù)

1.2.1 色譜條件

色譜柱：UPLC BEH C18型（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），美國Waters公司；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：1 μL；流動(dòng)相：甲酸溶液（體積分?jǐn)?shù)為0.01%）-乙腈，梯度洗脫程序見表1，流速為0.3 mL/min。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用正離子電噴霧離子源（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。其相關(guān)質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜條件

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

固相萃取小柱依次用6 mL二氯甲烷、6 mL甲醇、6 mL Na2EDTA溶液進(jìn)行活化。將500 mL水樣加入0.5 g Na2EDTA，調(diào)pH后過小柱，富集完成后用10 mL水淋洗，氮吹20 min，用10 mL洗脫液分2次進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干后用初始流動(dòng)相定容，過0.2 μm膜進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

分別選擇乙腈、甲醇與甲酸溶液配合作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖基線偏高，響應(yīng)值偏低，而乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖基線穩(wěn)定，響應(yīng)值較高。

采用正離子電離模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，常使用具有一定酸度的流動(dòng)相，以使目標(biāo)物容易質(zhì)子化而帶正電荷，通過提高離子化效率增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度。比較了0.01%，0.05%和0.1%的甲酸及純水作為流動(dòng)相對(duì)抗生素分離效果的影響，結(jié)果表明，0.01%甲酸分離效果最佳且目標(biāo)化合物有較高的響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈和0.01%甲酸混合溶液作為流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

四環(huán)素類是兩性物質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)，電離時(shí)會(huì)同時(shí)產(chǎn)生正負(fù)離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明正離子采集的信號(hào)較強(qiáng)，因此以正離子方式（ESI+）進(jìn)行采集。采用質(zhì)量濃度為1 mg/L的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液以Infusion的方式進(jìn)行母離子全掃描，得到其準(zhǔn)分子離子峰，然后分別以其準(zhǔn)分子離子為母離子，通過氬氣碰撞產(chǎn)生碎片離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選擇豐度較高的碎片離子作為定性與定量特征離子，選擇MRM掃描模式對(duì)母離子與子離子進(jìn)行碎裂電壓及碰撞電壓的優(yōu)化，提高檢測(cè)的靈敏度，優(yōu)化后的參數(shù)見表2。

2.3 固相萃取條件優(yōu)化

SPE柱類型、洗脫劑和洗脫劑用量、上樣體積和流速、pH等都會(huì)影響SPE萃取的效率，筆者以空白加標(biāo)回收率為評(píng)價(jià)依據(jù)分別對(duì)這些實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

分別考察了HLB柱和普通C18小柱對(duì)目標(biāo)化合物的萃取效果，HLB柱填充的是親水、親脂平衡的水可浸潤型的反相吸附劑，研究發(fā)現(xiàn)，HLB對(duì)目標(biāo)化合物的萃取效率遠(yuǎn)高于C18柱，因此選擇HLB小柱對(duì)樣品進(jìn)行富集和凈化。

比較了樣品pH對(duì)提取效率的影響。發(fā)現(xiàn)提取效率在pH 3時(shí)優(yōu)于pH 7時(shí)，因此水樣和活化小柱所采用的Na2EDTA溶液均用1 mol/L硫酸溶液調(diào)至pH 3。

分別用甲醇、乙腈、酸化的甲醇（0.1%甲酸溶液）、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇（1∶4）作為洗脫液進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)使用酸化的甲醇洗脫效率最高且重現(xiàn)性好，因此洗脫液采用含0.1%甲酸的甲醇溶液。

上樣流速分別為5，10，15 mL/min時(shí)，發(fā)現(xiàn)空白加標(biāo)的回收率在流速為5，10 mL/min時(shí)沒有顯著差異，而在流速為15 mL/min時(shí)回收率有明顯下降，所以選擇上樣速率為10 mL/min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

TC，OTC，ROX 3種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖1所示。由圖1可見，在1.2儀器工作條件下，3種目標(biāo)化合物5 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)良好分離。

圖1 3種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖

2.5 線性范圍、檢出限和精密度

將TC，OTC，ROX儲(chǔ)備液（200 mg/L）用初始流動(dòng)相稀釋至標(biāo)準(zhǔn)溶液系列（TC，OTC 1.0～100 μg/L，ROX 0.1～10 μg/L），按照1.2儀器工作條件進(jìn)行分析。以定量離子對(duì)的響應(yīng)面積與對(duì)應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。目標(biāo)化合物在此范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。以10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液（ROX 1 μg/L）重復(fù)進(jìn)樣7次驗(yàn)證儀器精密度，發(fā)現(xiàn)7次進(jìn)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～5.6%。以2～5倍基線噪音響應(yīng)對(duì)應(yīng)的濃度進(jìn)行空白加標(biāo)，以3倍信噪比（S/N）估算方法檢出限，3種目標(biāo)化合物的檢出限介于0.08～0.35 ng/L之間，其線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表3。

表3 3種目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.6 水樣分析及加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

在空白水樣中分別添加目標(biāo)化合物進(jìn)行空白加標(biāo)回收試驗(yàn)，采用外標(biāo)法定量。為了考察不同的水體機(jī)制對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，同時(shí)進(jìn)行了實(shí)際水樣的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果列于表4。由表4可知，TC，OTC，ROX 3種目標(biāo)化合物在空白水和實(shí)際水樣中的加標(biāo)回收率分別為82.5%～114%和71.5～126%，測(cè)量準(zhǔn)確度能夠滿足實(shí)驗(yàn)的需要。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3 結(jié)語

用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水中的四環(huán)素、土霉素、羅紅霉素，分析速度快，精密度、準(zhǔn)確度良好，檢出限低，適合快速檢測(cè)各種水體中的抗生素類污染物。

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