劉長富，郭 志，司同國，邢文閣，劉 方，于海鵬

高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，參與包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)等多種生物學(xué)過程［1-2］，釋放至細(xì)胞外的HMGB1可作為內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)因子，影響免疫反應(yīng)的啟動和激烈程度［3-4］。相關(guān)研究顯示，HMGB1在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)［1，5-7］，冷凍消融治療是否能在導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞壞死的同時使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的HMGB1釋放至細(xì)胞外，這些釋放的HMGB1是否能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞（DC）數(shù)量增加及增高其活化程度，進(jìn)而對冷凍免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響，目前尚少見相關(guān)研究報道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及實驗動物皮下移植瘤模型建立

小鼠前列腺癌細(xì)胞 （RM-1）株由上海中科院細(xì)胞庫提供。清潔級純種近交系C57BL/6（H-2Db/b）雄性小鼠50只，6～8周齡，體重18～22 g，購自中國科學(xué)院天津血液病研究所實驗動物中心。取對數(shù)生長期的RM-1細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度至5×106個/ml。取雄性C57BL/6小鼠，用1 ml注射器將0.1 ml腫瘤細(xì)胞接種于右腹股溝皮下，每3 d觀察腫瘤生長情況。

1.2 實驗分組

將50只RM-1細(xì)胞激素非依賴性前列腺癌模型小鼠隨機(jī)分為對照組25只，不予任何治療；治療組25只，給予冷凍消融治療。

1.3 氬氦冷凍消融治療技術(shù)操作步驟

接種腫瘤后第2周（腫瘤直徑約1 cm），于荷瘤鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉后，仰臥固定于操作臺上。采用的氬氦冷凍消融系統(tǒng)（CryocareTMSurgical System）為美國Endocare公司產(chǎn)品。右側(cè)腹股溝處常規(guī)消毒、鋪巾，在瘤旁切一小口，直視下將直徑1.7 mm的氬氦冷凍探針刺入腫瘤組織內(nèi)6～8 mm。啟動氬氣，工作壓力17 225 kPa（2 500 psi），初始功率均為20%條件下，冷凍時間為30 s，冰球完全覆蓋腫瘤，可見腫物表面完全覆蓋凍霜，中央溫度可達(dá)－120℃，啟動氦氣復(fù)溫至10℃，為第1個冷凍循環(huán)。同樣方法重復(fù)第2個冷凍循環(huán)。冷凍治療結(jié)束后拔出冷凍器，縫合皮膚。

1.4 標(biāo)本采集

兩組分別于治療前、治療后1、7、14、21 d各取5只小鼠，無菌條件下，取腫瘤組織并制備單細(xì)胞懸液。

1.5 Western印跡及流式細(xì)胞儀檢測

采用Western印跡法檢測不同時間點腫瘤局部組織中HMGB1表達(dá)情況，Western印跡反應(yīng)結(jié)果應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）照相記錄，應(yīng)用QuantityOne Basic軟件進(jìn)行條帶灰度掃描，計算積分吸光度（IA）值。收集的細(xì)胞懸液混勻后，分別取100 μl加入離心管，分別標(biāo)定為CD11c、CD86、CD80，同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)對照管，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）檢測細(xì)胞表面抗體的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將數(shù)據(jù)統(tǒng)一編碼后，錄入EXCEL數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示。組內(nèi)不同時間點的比較采用ANOVA方差分析、各時間點兩組之間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗、相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前、后腫瘤局部組織中HMGB1表達(dá)

與術(shù)前比較，治療組術(shù)后第7天腫瘤局部組織中HMGB1表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01），隨時間延長逐漸下降，至術(shù)后21 d恢復(fù)至術(shù)前水平 （P＞0.05）。對照組腫瘤局部HMGB1表達(dá)水平無明顯改變，各時間點之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。相同時間點腫瘤局部HMGB1表達(dá)水平在術(shù)后1、7、14 d治療組均高于對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。 見表1 和圖1。

2.2 治療前、后腫瘤局部浸潤DC細(xì)胞比例變化

表1 術(shù)后腫瘤局部HMGB1蛋白表達(dá)水平變化 （n=5，±s）

表1 術(shù)后腫瘤局部HMGB1蛋白表達(dá)水平變化 （n=5，±s）

注：a與術(shù)前比較 P ＜ 0.05；b與對照組比較 P ＜ 0.05

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圖1 治療組術(shù)后腫瘤局部HMGB1表達(dá)水平

與術(shù)前比較，治療組術(shù)后第7天腫瘤局部組織中DC細(xì)胞比例顯著增高（P＜0.01），隨時間延長逐漸下降，至術(shù)后 21 d恢復(fù)至術(shù)前水平（P ＞0.05）。對照組腫瘤局部DC細(xì)胞比例無明顯改變，各時間點之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療組術(shù)后1、7、14 d相同時間點腫瘤局部DC細(xì)胞比例均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見表2。

表2 腫瘤局部DC細(xì)胞比例變化 （n=5，±s）

表2 腫瘤局部DC細(xì)胞比例變化 （n=5，±s）

注：a與術(shù)前比較 P ＜ 0.05；b與對照組比較 P ＜ 0.05

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2.3 冷凍消融治療對腫瘤局部DC活化比例的影響

與術(shù)前比較，治療組術(shù)后第1天腫瘤局部DC活化比例開始增多（P＜0.01），于術(shù)后第7天達(dá)最高值（P ＜ 0.01），之后隨時間延長，逐漸下降，至術(shù)后第21天恢復(fù)至術(shù)前水平（P＞0.05）。對照組腫瘤局部DC活化比例無明顯改變，各時間點之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。 術(shù)后 1、7、14 d 相同時間點腫瘤局部DC活化比例治療組均高于對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見表3。

表3 治療后腫瘤局部DC活化比例變化 （n=5，±s）

表3 治療后腫瘤局部DC活化比例變化 （n=5，±s）

注：a與術(shù)前比較 P ＜ 0.05；b與對照組比較 P ＜ 0.05

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治療組腫瘤局部HMGB1表達(dá)量與DC數(shù)量、活化比例均成高度正相關(guān)（r=0.883，r=0.997，P ＜0.05）。

3 討論

HMGB1廣泛分布于高等生物真核細(xì)胞核內(nèi)，多種病理過程中組織細(xì)胞的壞死和損傷，均可使核內(nèi)的HMGB1游離并釋放至細(xì)胞外甚至血清中，作為細(xì)胞因子的HMGB1釋放到細(xì)胞外可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)［3-4］。相關(guān)研究顯示HMGB1在多種腫瘤均呈高表達(dá)［1，5-7］，氬氦冷凍消融治療作為一種物理消融治療方式能短時間內(nèi)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死，在腫瘤細(xì)胞壞死的同時是否會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)HMGB1釋放至細(xì)胞外，以及HMGB1釋放至細(xì)胞外的量與時間的關(guān)系如何，國內(nèi)外尚少見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

本實驗結(jié)果顯示，對荷瘤小鼠實施冷凍消融治療后腫瘤局部組織中HMGB1明顯增高，并于術(shù)后第7天達(dá)最高值，之后隨著時間延長逐漸下降于術(shù)后第21天恢復(fù)至術(shù)前水平。以往實驗結(jié)果證實，HMGB1 在前列腺癌組織中高表達(dá)［1，7］。冷凍消融治療可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量壞死，而細(xì)胞壞死或損傷是HMGB1釋放的重要途徑之一［8］，因此我們有理由相信腫瘤組織局部存在的大量HMGB1是由冷凍消融導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死后釋放至細(xì)胞外。同時本實驗結(jié)果亦顯示在接受冷凍消融治療后，HMGB1于術(shù)后第7天達(dá)到最高值，分析其原因主要為：氬氦冷凍消融治療可使腫瘤組織快速冷至－160℃以下，可直接引起癌細(xì)胞脫水和破裂；同時也會破壞腫瘤小血管而致缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致更多的腫瘤細(xì)胞死亡［9］，釋放更多的HMGB1。

新近研究表明，作為免疫佐劑的HMGB1能夠加速炎性粒細(xì)胞向抗原侵入的地方移動，并能促進(jìn)APC和DC活化，并且能加速他們到達(dá)淋巴結(jié)及促進(jìn)靜止的T淋巴細(xì)胞活化，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性因子釋放，間接影響其他免疫細(xì)胞［10-13］。有關(guān)壞死細(xì)胞反應(yīng)的成熟DC細(xì)胞中是否含有HMGB1的研究結(jié)果顯示，在壞死的海拉癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清液中含有具有HMGB1的成熟的DC細(xì)胞，在上清液中加入HMGB1抗體能阻止DC成熟，缺乏HMGB1的上清液中壞死細(xì)胞誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟作用明顯減弱［14］。冷凍消融導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死釋放的HMGB1對DC數(shù)量的變化及活化程度能夠產(chǎn)生何種影響，本研究將腫瘤局部組織中DC數(shù)量、DC活化比例與腫瘤組織局部HMGB1的表達(dá)水平行相關(guān)分析，結(jié)果顯示DC細(xì)胞數(shù)量及活化程度與腫瘤組織HMGB1表達(dá)水平呈高度正相關(guān)關(guān)系。說明冷凍消融治療后機(jī)體內(nèi)HMGB1介導(dǎo)了體內(nèi)DC數(shù)量、DC活化比例的增高。上述結(jié)果說明單純冷凍消融治療能夠通過HMGB1釋放刺激機(jī)體DC數(shù)量增加和活化程度提高，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。

然而，HMGB1通過何種確切的機(jī)制實現(xiàn)對DC以及冷凍免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有待深入研究。隨著對冷凍免疫反應(yīng)及其受體調(diào)控機(jī)制研究的深入及相關(guān)信號通路的逐漸闡明，將為冷凍免疫反應(yīng)研究開辟新途徑。

［1］Todorova J，Pasheva E.High mobility group B1 protein interacts with its receptor RAGE in tumor cells but not in normal tissues［J］.Oncol Lett，2012，3： 214-218.

［2］Thomas JO，Stott K.H1 and HMGB1： modulators of chromatin structure［J］.Biochem Soc Trans，2012，40： 341-346.

［3］曹清心，劉 宇，凌昌全.HMGB1與腫瘤相關(guān)性的研究進(jìn)展［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2012，17： 282-285.

［4］Kokkola B，Andersson A，Mullins G，et al.RAGE is the major receptor for the proinflammatory activity of HMGBI in rodent macrophages［J］.Scand J Immunol，2005，61： 1-9.

［5］Chen J，Xi B，Zhao Y，et al.High-mobility group protein B1（HMGB1） is a novel biomarker for human ovarian Cancer［J］.Gynecol Oncol，2012，126： 109-117.

［6］周寶勇，鄭 軍，侯俊丞，等.HMGB1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與VEGF、MVD的關(guān)系 ［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，37： 409-412.

［7］Mengus C，Le Magnen C，Trella E，et al.Elevated levels of circulating IL-7 and IL-15 in patients with early stage prostate cancer［J］.J Transl Med，2011，9： 162.

［8］Barqasho B，Nowak P，Abdurahman S，et al.Implications of the release of high-mobility group box 1 protein from dying cells during human immunodeficiency virus type 1 infection in vitro［J］.J Gen Virol，2010，91： 1800-1809.

［9］Pitman M，Shapiro EY，Hruby GW，et al.Comparison of biochemicalfailure definitionsforpredicting localCancer recurrence following cryoablation of the prostate ［J］.Prostate，2012，72：1802-1808.

［10］Penza P，Moniuszko A，Zajkowska J.High mobility group box I（HMGB1） and its effect on dendritic cells ［J］.Pol Merkur Lekarski，2012，33： 129-132.

［11］Allonso D，Belgrano FS，Calzada N，et al.Elevated serum levels of high mobility group box 1 （HMGB1） protein in dengueinfected patients are associated with disease symptoms and secondary infection［J］.J Clin Virol，2012，55： 214-219.

［12］Yang D，Chen Q，Yang H，et al.High mobility group box-1 protein induces the migration and activation of human dendritic cells and acts as an alarmin ［J］.J Leukoc Biol，2007，81： 59-66.

［13］Chiba S，Baghdadi M，Akiba H，et al.Tumor-infiltrating DCs suppress nucleic acid-mediated innate immune responses through interactions between the receptor TIM-3 and the alarmin HMGB1［J］.Nat Immunol，2012，13： 832-842.

［14］Rovere-Querini P，Capobianco A，Scaffidi P，et al.HMGB1 is an endogenous immune adjuvant released by necrotic cells［J］.EMBO Rep，2004，5： 825-830.