鄧俊峰羅志廣黃俊青楊國(guó)良

1.深圳寶安石巖人民醫(yī)院，廣東深圳518108;2.深圳市寶安區(qū)西鄉(xiāng)人民醫(yī)院，廣東深圳518108

尋常性銀屑病俗稱牛皮癬，是一種常見(jiàn)的具有特征性皮損的慢性易于復(fù)發(fā)的皮膚病。該病頑固難治，是當(dāng)今世界皮膚科領(lǐng)域的重要研究課題，是全世界皮膚科重點(diǎn)防治疾病之一。目前Th17細(xì)胞在銀屑病發(fā)病過(guò)程中的作用越來(lái)越引起人們的重視，研究認(rèn)為T(mén)h17細(xì)胞及相關(guān)因子IL-17、IL-22表達(dá)與尋常性銀屑病患者疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[1]。該研究旨在探討尋常性銀屑病患者外周血和皮損中Th17細(xì)胞及相關(guān)因子IL-17、IL-22表達(dá)，選取2012年1月—2012年12月該院收治的127例銀屑病患者分成兩組，門(mén)診就醫(yī)確診的銀屑病患者78例為實(shí)驗(yàn)組，另選取門(mén)診和住院外科手術(shù)患者48例無(wú)銀屑病等免疫相關(guān)性疾病為對(duì)照組，分析其與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)組：參照1991年10月中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)會(huì)頒布的尋常性銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)，遴選病例。對(duì)照組：所選病例近1個(gè)月未作局部治療，2個(gè)月內(nèi)未作任何免疫抑制劑治療，無(wú)其他免疫性皮膚病及系統(tǒng)性疾病，觀察前1個(gè)月內(nèi)無(wú)細(xì)菌、真菌、病毒感染，既往無(wú)銀屑病等免疫相關(guān)皮膚疾病。

1.2 研究對(duì)象

選取該門(mén)診就醫(yī)確診的銀屑病患者78例為實(shí)驗(yàn)組，男49例，女29例，年齡24～65歲，平均43歲，病程4個(gè)月～22年，平均8.5年，PASI[2]評(píng)分22～60.6分。另外選取門(mén)診和住院外科手術(shù)患者48例(無(wú)銀屑病等免疫相關(guān)性疾病)為對(duì)照組，男29例，女19例，年齡25～63歲，平均44歲。

1.3 主要試劑

兔抗CD4、兔抗IL-17（北京中杉金橋公司），量子點(diǎn)雙染熒光試劑盒（武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)有限公司）,流式抗體藻紅蛋白一青色素染料5(PE-cy5)抗人CD3，F(xiàn)ITC抗人CD8，藻紅蛋白(PE)抗人 IL一 17A，PE鼠IgG同型對(duì)照（美國(guó) eBioscience公司）,佛波酯肉豆蔻酸乙酸鹽(PMA)、莫能星鈉鹽、伊屋諾霉素鈣鹽購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，F(xiàn)IX&PERM（聯(lián)科生物科技有限公司），IL-17、IL-22ELISA試劑盒（聯(lián)科生物科技有限公司），多光譜成像儀（Nuance美國(guó)劍橋儀器公司），F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀 （美國(guó)BD公司）。

1.4 研究方法

1.4.1 組織中Th17細(xì)胞的表達(dá) 收集實(shí)驗(yàn)組患者典型皮損組織和對(duì)照組正常皮膚組織。所取組織常規(guī)石蠟包埋，切片厚度3 μm，切片脫蠟水化，微波抗原修復(fù)，滴加稀釋的CD4一抗，37℃濕盒孵育 2 h。加吐溫 20的 Tris緩沖鹽水(TBs-T)洗滌(3×5 min)，滴加緩沖液，37℃濕盒孵育封閉10 min；滴加稀釋的生物素化IgG，37℃濕盒孵育30 min；緩沖液封閉20 min；滴加稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈酶親和素復(fù)合物 (QDs-SA)，37℃濕盒孵育30 min；TBS-T洗滌(3×5 min)，滴加緩沖液。37℃濕盒孵育封閉10 min；滴加稀釋的IL-17一抗，4℃過(guò)夜。TBS-T洗滌(3×5 min)，滴加緩沖液，37℃濕盒孵育封閉20 min；滴加稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫球蛋白 G 復(fù)合(QDs-IgG)，37℃濕盒孵育 30 min；TBS-T 洗滌(3×5 min)，Tris緩沖鹽水(TBS)洗滌(2×5 min)。緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)觀察成像,多光譜分析儀分析結(jié)果存盤(pán)。QDs-SA波長(zhǎng)605 nm，發(fā)紅光，QDs-IgG波長(zhǎng)525 nm，發(fā)綠光。紅色信號(hào)為CD4，綠色信號(hào)為IL-17+，黃色區(qū)域CD4+IL-17+即為T(mén)h17細(xì)胞。

1.4.2 Th17細(xì)胞流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù) 采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組靜脈血2 mL，肝素鈉抗凝，24 h內(nèi)檢測(cè)。取1只試管加入150 μL血液和150 μL RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，加入LPMA工作液、伊屋諾霉素工作液和莫能星工作液，混勻，37℃、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，進(jìn)行破膜和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞熒光抗體染色陽(yáng)性率，即CD4+CD8-IL-17+細(xì)胞群所占的百分比。

1.4.3 血清中IL-17、IL-22的檢測(cè) 采集銀屑病患者和正常人對(duì)照者靜脈血3 mL，靜置留取血清500 μL，置于-20℃保存待檢。按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，酶標(biāo)儀讀取A值。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)結(jié)果以（±s）表示，采用χ2檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。

2 結(jié)果

2.1 組織中Th17細(xì)胞表達(dá)比例

實(shí)驗(yàn)組患者組織中Th17細(xì)胞表達(dá)比例為(3.1±1.0)%，對(duì)照組為(0.4±0.2)%,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 尋常型銀屑病患者Th17細(xì)胞中的CD4及IL-17抗體表達(dá)陽(yáng)性率比較

實(shí)驗(yàn)組患者CD4及IL-17抗體陽(yáng)性表達(dá)率為(2.9±1.1)%，對(duì)照組為(0.5±0.4)%,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。銀屑病患者Th17細(xì)胞中的CD4及IL-17抗體表達(dá)陽(yáng)性率與PASI無(wú)相關(guān)性(r=0.321,P>0.05)。

2.3 銀屑病患者外周血中IL-17和IL-23水平比較

實(shí)驗(yàn)組患者外周血IL-17和IL-23表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，并與 PASI呈正相關(guān)(r=0.501,P<0.05)，見(jiàn)表 1。

表1 銀屑病患者外周血中IL-17和IL-23水平比較

3 討論

銀屑病是皮膚科最為常見(jiàn)的一種慢性的具有特征性皮損的炎癥性皮膚病，皮損可僅僅發(fā)生在身體的某一個(gè)部位，也可以遍布全身各處。表現(xiàn)為紅色的丘疹、紅斑或大小不等的扁平斑塊[2-3]。上面覆蓋著厚薄不等、容易脫落的銀白色鱗屑。把鱗屑刮掛去后，可見(jiàn)到一層光滑的紅色薄膜，再把薄膜揭去，即可見(jiàn)到一些細(xì)如針尖的出血點(diǎn)。這種紅色薄膜和點(diǎn)狀出血的現(xiàn)象，是尋常型銀屑病的重要特征[4]。且銀屑病還具有復(fù)發(fā)性和持續(xù)性，這對(duì)患者的身心健康和生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重的影響，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所對(duì)皮膚病作了大量研究，結(jié)果表明銀屑病在皮膚科門(mén)診總量中占有較大的比例[5-6]，且患病人數(shù)逐年增加，但目前尚沒(méi)有能根治銀屑病有效治療手段，所以新的治療方法和治療藥物急需解決。

研究證明,在銀屑病的發(fā)生發(fā)展全過(guò)程中免疫細(xì)胞和炎癥因子起到了重要作用[3]，該研究發(fā)現(xiàn)尋常性銀屑病患者外周血和皮損中Thl7細(xì)胞及相關(guān)因子IL-17、IL--22表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示銀屑病患者外周血IL-17和IL-23高表達(dá),可能是銀屑病免疫發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。因此該研究認(rèn)為可以通過(guò)對(duì)IL-23/Th17細(xì)胞通路進(jìn)行干預(yù)，而找到診斷和治療尋常性銀屑病的新途徑和新藥物。這將對(duì)治療尋常性銀屑病有很大幫助。

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