姜 萍，李 曉

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附院內(nèi)科，濟(jì)南 250011)

自發(fā)性糖尿病大鼠(Goto-Kakizaki diabetes prone rat，GK大鼠)是研究糖尿病的較好模型，比目前常用的鏈脲霉素模型更能符合人類2型糖尿病特點(diǎn)。在糖尿病心肌病變發(fā)展過程中，研究顯示炎癥因子可造成微血管及心肌的損傷［1］，從中醫(yī)病因病機(jī)學(xué)說可概括歸納為糖毒蘊(yùn)結(jié)、熱毒耗傷心絡(luò)心體。黃連解毒湯是清熱解毒的代表方劑，本實(shí)驗(yàn)采用GK大鼠主要觀察黃連解毒湯對(duì)自發(fā)性糖尿病大鼠心肌炎癥因子的影響及對(duì)心肌損傷的防治作用，為防治糖尿病心肌病變提供新思路和證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

GK3月齡雄性大鼠30只(中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)0005569)，體質(zhì)量210～300g，隨機(jī)分為黃連解毒湯組、二甲雙胍組、GK對(duì)照組3組。另取普通級(jí)4月齡雄性Wister大鼠10只作為正常對(duì)照組，體質(zhì)量330～410g(山東大學(xué)新藥評(píng)價(jià)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)200203)。

1.2 藥品及試劑

實(shí)驗(yàn)用藥:按照黃連解毒湯原方比例制備水煎劑，濃縮至1g生藥/ml(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室完成)，將二甲雙胍等配制成合適的懸濁液。

試劑:核因子-κB(goat anti Nuclear factor-κB，NF-κB);酶聯(lián)免疫試劑盒(美國(guó)adlitteram diagnostic laboratories INC，ADL CD A-011，LOT RT110371);細(xì)胞間黏附分子(sICAM-1)酶聯(lián)免疫試劑盒(美國(guó)R＆D Systems Inc，Cat No:SXR060 Lot No.0701120，中國(guó)尚柏公司代理);白介素-1(IL-1)酶聯(lián)免疫試劑盒(美國(guó)R＆D Systems Inc，Cat No:SXR019 Lot No.:0701119);Sun Biomedical Technology Co.，Ltd 中國(guó)尚柏公司代理);腫瘤壞死因子(TNF-α)放射免疫試劑盒;內(nèi)皮素(ET-1)放射免疫試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，原北京東亞免疫技術(shù)研究所)。主要實(shí)驗(yàn)儀器:勻漿機(jī)(IKA-ULTRA-TURRAX T 25basic);ELx808酶標(biāo)儀(美國(guó) BIO-TEK INSTRUMENTS，INC);GMJ型全自動(dòng)放射免疫γ計(jì)數(shù)器(江蘇省醫(yī)療電子研究所);DDL-5冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1 分組用藥

給藥劑量相當(dāng)于人口服10倍量。各組按以下方式飼養(yǎng)及灌胃給藥12周。各組給予正常飼料喂養(yǎng)的同時(shí)分組給藥，黃連解毒湯組給予水煎劑9.0g/kg·d，西藥組給予二甲雙胍0.125g/kg·d，正常對(duì)照組和GK對(duì)照組分別給予生理鹽水2mL/kg·d。

2.2 標(biāo)本處理及制作

按上述方法灌胃12周，因動(dòng)物灌胃等死亡，黃連解毒湯組9只，其他組均為8只。禁食不禁水12h，以上動(dòng)物行氯胺酮腹腔麻醉、解剖，腹主靜脈取血，采用強(qiáng)生公司One Touch Profile血糖儀測(cè)定血糖。取心臟立即用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，沖洗后在冰上操作，沿左心室方向解剖。用4%多聚甲醛固定，連續(xù)做病理切片，片厚5um，行HE染色。取新鮮心肌組織，每克心肌組織加5ml生理鹽水置勻漿機(jī)上10000r/min 10s×3次，制備20%心肌組織勻漿，4000r/min離心10min，取上清液4℃保存待測(cè)。

2.3 觀察項(xiàng)目及檢測(cè)方法

NF-κB、sICAM-1、IL-1 采用酶標(biāo)雙抗體夾心法測(cè)定。根據(jù)曲線方程計(jì)算各樣品NF-κB、sICAM-1、IL-1濃度。TNF-α、ET-1采用放免法測(cè)定，由儀器自動(dòng)計(jì)算各樣品含量。取各組心肌HE染色切片光鏡下觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均由SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)處理。各組均數(shù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后采用方差分析，均值間兩兩比較用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 各組動(dòng)物血糖及心肌勻漿炎癥因子含量

表1顯示，計(jì)算各組動(dòng)物血糖及心肌勻漿NF-κB、sICAM-1、IL-1、TNF-α、ET-1 等炎癥因子含量。

表1 各組大鼠血糖及心肌勻漿炎癥因子比較(±s)

表1 各組大鼠血糖及心肌勻漿炎癥因子比較(±s)

組 別 例數(shù) 血糖(mmol/L)NF-κB(ng/ml)sICAM-1(ng/ml)TNF-α(pg/ml)IL-1(pg/ml)ET-1(pg/ml)正 常 大 鼠 8 4.27±0.88 236.20± 53.70 306.20± 58.60 350.60±31.30 53.62±11.00 48.10± 3.70 GK 對(duì) 照 8 8.72±0.73★★ 609.80± 49.40★★ 501.90± 75.70★★ 833.12±31.60★★ 96.77±31.35★★ 160.00± 7.28★★二 甲 雙 胍 8 6.14±0.90＊＊ 601.03±154.90 422.98±129.27 776.25±15.90＊＊ 75.78±11.50* 141.67±28.70黃連解毒湯組 9 5.70±0.74＊＊ 533.73± 65.90＊＊△ 392.78± 66.20＊＊ 602.70±40.30＊＊△△ 55.93±12.80＊△△ 105.35± 7.10＊＊△△

注:GK對(duì)照組與正常大鼠組比較:★P＜0.05，★★P＜0.01;各組與GK對(duì)照比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;中藥組與二甲雙胍組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，GK對(duì)照組血糖明顯升高，黃連解毒湯組、二甲雙胍組血糖均下降，差異有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，2藥物組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與正常對(duì)照組比較，GK對(duì)照組各炎癥因子明顯升高(P＜0.01)。與GK對(duì)照組比較，二甲雙胍組IL-1、TNF-α下降(P＜0.05)，黃連解毒湯組各炎癥因子明顯降低(P＜0.05)，黃連解毒湯與二甲雙胍比較，各炎癥因子下降程度較大，其中 NF-κB、TNF-α、ET-1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

綜上分析，黃連解毒湯和二甲雙胍能均能顯著降低血糖，但在降低炎癥因子方面，黃連解毒湯優(yōu)于二甲雙胍。

3.2 切片鏡下觀察所見

正常大鼠可見心肌纖維清晰，心肌排列規(guī)則，未見變性壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖1)。GK對(duì)照組可見部分心肌纖維呈灶性肥大，并見較多細(xì)小空泡，心肌細(xì)胞變大變寬，核偏向一側(cè)，部分心肌纖維橫紋消失，部分心肌呈蜂窩狀僅存肌膜，心肌間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生(見圖2)。二甲雙胍組部分心肌纖維呈灶性肥大，心肌細(xì)胞變大變寬，核偏向一側(cè)，程度有所減輕，部分心肌間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生(見圖3)。黃連解毒湯組病變的心肌纖維程度明顯減輕，僅見個(gè)別心肌細(xì)胞肥大，核偏位(見圖4)。

4 討論

黃連解毒湯收載于唐·王燾所著的《外臺(tái)秘要》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥組成，具有瀉火解毒之功效，是清熱解毒的代表方。既往研究證明，黃連解毒湯有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂之功效，可多靶點(diǎn)改善胰島素抵抗等［2］，其抗炎作用與抑制IL-1、TNF-α等炎癥因子表達(dá)、抑制中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附有關(guān)［3］。近年來(lái)研究表明，黃連解毒湯可提高2型糖尿病脂肪和肌肉組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4的蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)位［4］，可降低2型糖尿病大鼠血清中白介素1、4、6、10、腫瘤壞死因子、C 反應(yīng)蛋白的水平［5，6］。

糖尿病早期即可出現(xiàn)微血管內(nèi)皮功能損傷和血管活性物質(zhì)分泌異常［7］，目前對(duì)糖尿病心肌及微血管病變的確切發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，涉及糖基化終產(chǎn)物(AGEs)形成、多元醇通路活躍、氧化應(yīng)激增加、己糖通路活躍、蛋白激酶 C(PKC)激活等等［8，9］。在上述多種機(jī)制中，高血糖可增強(qiáng)氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激可激活幾乎所有已知的有關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通道，通過激活核因子-κB(NF-κB)上調(diào)黏附分子及炎性因子基因轉(zhuǎn)錄［10］。糖基化終產(chǎn)物(AGEs)也可激活蛋白激酶通路及 NF-κB 信號(hào)通路［11］。

圖1 正常對(duì)照組(HE染色×200倍)

圖2 GK對(duì)照組(HE染色×200倍)

NF-κB能引起一系列參與炎癥和免疫反應(yīng)基因的表達(dá)增加，如 TNF-α、IL-1、sICAM-1、ET-1、血管細(xì)胞黏附分子、選擇素等，反過來(lái)，TNF-α和IL-1又能激活NF-κB，NF-κB 起著中心調(diào)控作用［12］。多種免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附等有關(guān)的細(xì)胞因子作用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞或血細(xì)胞，導(dǎo)致局部炎癥、微循環(huán)障礙的發(fā)生，隨著病程延長(zhǎng)，微血管、心肌損傷、心肌纖維化，最終導(dǎo)致糖尿病心肌病變。因此，糖尿病心肌病變是一種輕度的亞急性或慢性炎癥性病變［13］。

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，一般認(rèn)為其病機(jī)為“陰虛燥熱”，我們認(rèn)為糖尿病心肌病變的中醫(yī)基本病機(jī)為燥熱郁久、糖毒蘊(yùn)結(jié)、火化為毒、熱毒內(nèi)蘊(yùn)、耗傷心絡(luò)心體。糖尿病心肌損傷的病理生理機(jī)制比較復(fù)雜，目前尚未完全闡明，炎癥損傷是其病理過程之一。本文對(duì)炎癥損傷過程進(jìn)行中醫(yī)理論探索，認(rèn)為既是病理產(chǎn)物又是致病因素的炎癥因子符合中醫(yī)學(xué)“內(nèi)生之毒”的性質(zhì)，高血糖及炎癥過程導(dǎo)致心肌損傷的病理機(jī)制與中醫(yī)學(xué)的“熱毒傷絡(luò)、心體失養(yǎng)”有非常密切的相關(guān)性。我們既往的臨床及實(shí)驗(yàn)研究［14～17］顯示，以清熱解毒為治法的心和顆粒劑調(diào)心飲，對(duì)不穩(wěn)定心絞痛有確切療效，可降低患者、高脂血癥大鼠模型、動(dòng)脈粥樣硬化家兔模型中有關(guān)炎癥因子含量及抑制心肌組織中NF-κB的表達(dá)等作用。

目前尚未見黃連解毒湯針對(duì)糖尿病心肌炎癥損傷的報(bào)道。有學(xué)者認(rèn)為，毒邪內(nèi)蘊(yùn)是導(dǎo)致糖尿病等代謝性疾病的重要原因之一，與炎癥有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路對(duì)上述疾病發(fā)生和發(fā)展具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，黃連解毒湯對(duì)上述疾病的治療作用，可能源于對(duì)多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，由此認(rèn)為對(duì)闡明黃連解毒湯的異病同治原理具有意義［18］。鑒于糖尿病的慢性炎癥病理特點(diǎn)，我們探討黃連解毒湯對(duì)糖尿病心肌病變的防治作用。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自發(fā)性糖尿病大鼠心肌勻漿中有關(guān)炎癥因子含量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，二甲雙胍能顯著降低IL-1、TNF-α，其原因可能與降低血糖有關(guān)。黃連解毒湯也能降低血糖，并能夠顯著降低NF-κB、sICAM-1、IL-1、TNF-α、ET-1 等，并在降低 NF-κB、TNF-α、ET-1方面優(yōu)于二甲雙胍，顯示了抗炎的獨(dú)特作用。病理切片顯示，能顯著減輕心肌損傷。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了黃連解毒湯能夠降低心肌勻漿中炎癥因子含量，可防治心肌炎癥損傷，為糖尿病心肌病變的治療提供了新證據(jù)。

圖3 二甲雙胍組(HE染色×200倍)

圖4 黃連解毒湯組(HE染色×200倍)

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