李晶，史玲玲，艾紅軍，徐堅，孫偉，鐘鳴

（1.遼寧省口腔醫(yī)學研究所，中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)學院修復科，沈陽 110002；2.中國科學院沈陽金屬研究所非晶合金組，沈陽110016；3.中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)學院中心實驗室，沈陽 110002）

目前CPTi和Ti-6Al-4V是臨床上應用最廣泛的牙科種植體材料，CPTi屬于惰性金屬，在體液中的耐腐蝕性高，長期使用后會在種植體周圍有鈦（Ti）離子析出，但是對人體無致敏性［1］；不會引起局部或者全身反應［2］，因而CPTi已經(jīng)被視為齒科種植體的金標準材料。但是鈦合金卻是臨床上應用最多的齒科植入合金，因為Ti-6Al-4V比CPTi具有更好的機械性能。國內外學者對這兩種材料的生物相容性的評價存在很大分歧.一部分學者認為這兩種材料植入體內后并無差異，如Espoeito等［3］在分析了多例失敗種植體的表面形態(tài)、成分和氧化物厚度后發(fā)現(xiàn)，無論是早期還是晚期失敗的種植體，其種植后表面氧化物的成分和厚度均未發(fā)生明顯的變化，也未發(fā)現(xiàn)引起種植體失敗與材料有關的因素；另一部分則認為CPTi要明顯優(yōu)于Ti-6Al-4V，在鈦合金的組成元素中，Steinemann已經(jīng)將Cu和V明確列為有毒元素，同時Ti-6Al-4V的耐腐蝕性能差，已有學者報道長期的體液腐蝕會導致Al、V等金屬離子的析出［4］，有研究證實，Ti-6Al-4V析出的金屬離子雖然不會對人體器官產(chǎn)生明顯的影響，但卻具有潛在的生物毒性風險［5］。

3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法是公認的、經(jīng)典的評價材料細胞毒性的體外實驗方法［6］，本研究選用了MTT法評價細胞毒性，還創(chuàng)新性地選用了人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HU） 進行培養(yǎng)，同時同步X射線光電子能譜分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析了細胞培養(yǎng)液浸泡前后合金表面組元狀態(tài)的變化，旨在檢測CPTi和Ti-6Al-4V對HU增殖的影響及CPTi和Ti-6Al-4V是否發(fā)生腐蝕或金屬離子溶解現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 金屬試件的制備

將CPTi和Ti-6Al-4V制作成直徑6 mm、厚度2 mm的金屬圓片（剛好放入96孔板的孔中），機械研磨后拋光，依次在丙酮、酒精和去離子水中超聲清洗、吹干，超凈工作臺中紫外線雙面照射各1h，備用。

1.2 細胞培養(yǎng)

HU（ATCC：CRL-1730）培養(yǎng)基選用高糖 DMEM（Gibieo）和10%胎牛血清（天津TBD公司），2～3 d換液，細胞生長至80%融合時進行傳代。

1.3 電鏡觀察

將CPTi和Ti-6Al-4V金屬試件放入96孔板的孔中，傳代后的HU（2×104/mL）接種于96孔板內，每種金屬每個時間點接種5孔，接種6 h后取出，然后固定，梯度乙醇脫水，樣本噴金，掃描電鏡下拍照。

1.4 MTT法檢測

將CPTi和Ti-6Al-4V金屬試件放入2塊無菌96孔板中，接種方法同1.3。每種金屬每個時間點接種8孔，同時設空白對照組8孔，即不放金屬試件的情況下接種細胞。設7個時間點：接種后4 h、1 d、2 d、3 d、7 d、10 d和14 d將孔內金屬試件移入新的96孔板中，每孔加入MTT（Amresco）溶液，放入培養(yǎng)箱孵育4 h后，取出，避光條件下加入二甲亞楓（Amresco）100 μL，570 nm 波長條件下酶標儀檢測光密度（optical density，OD）值。

1.5 XPS分析

使用ESCALAB250 X-光線電子能譜儀（美國Thermo VG公司）對拋光后以及細胞培養(yǎng)液浸泡7 d后的金屬片進行表面成分深度分析，獲得的全譜和精細譜，參照C 1 s峰位（284.6 eV）進行校正，使用XPSPEAK表面化學分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.6 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電鏡觀察結果

如圖1所示，HU接種到CPTi和Ti-6Al-4V 6 h后500倍電鏡下觀察到細胞呈現(xiàn)卵圓形，在材料表面自由鋪展，2種材料細胞的數(shù)量、大小和形態(tài)基本沒有差別（圖1A，1B）；5 000倍電鏡下，觀察到細胞呈攤開的“雞蛋餅”狀，在材料上自由鋪展，向四周伸出很多偽足，細胞表面分泌很多球蛋白使細胞表面凹凸不平（圖1C，1D）；10 000倍電鏡下觀察到細胞的絲狀偽足非常清晰，其上附掛有許多球蛋白，相鄰細胞間通過偽足緊密接觸（圖1E，1F）。

2.2 MTT結果

如表1所示，接種后HU數(shù)量隨時間延長先是逐漸增多，在3 d時達到飽和之后降低。4 h、1 d和3 d時，CPTi、Ti-6Al-4V材料和對照組所測的OD值沒有統(tǒng)計學差異（P>0.05）；而 2 d、7 d、10 d 和 14 d時CPTi和Ti-6AL-4V材料所測的OD值沒有統(tǒng)計學差異（P>0.05），但都顯著低于對照組（P<0.05）。

表1 3組材料接種后HU細胞數(shù)量MTT結果比較（±s）Tab.1 MTT results of 3 types of material after inoculation（±s）

表1 3組材料接種后HU細胞數(shù)量MTT結果比較（±s）Tab.1 MTT results of 3 types of material after inoculation（±s）

1）P<0.05 vs control group.

OD value 4 h 1 d 2 d 3 d 7 d 10 d 14 d CPTi 0.067±0.03 0.120±0.03 0.232±0.051） 0.731±0.03 0.223±0.031） 0.240±0.071） 0.185±0.031）Ti-6-Al-4V 0.090±0.01 0.139±0.02 0.226±0.031） 0.705±0.04 0.321±0.031） 0.246±0.021） 0.161±0.031）Control 0.078±0.02 0.166±0.01 0.404±0.08 0.660±0.05 0.725±0.03 0.487±0.09 0.277±0.04 Group

2.3 XPS結果

如圖2所示，CPTi在拋光后以及細胞培養(yǎng)液中浸泡7 d后表面層Ti、O組元的XPS分析可以發(fā)現(xiàn)隨著濺射深度的增加，Ti元素含量逐漸由16 at.%增加至穩(wěn)定，氧元素含量逐漸降低，氧元素的深度分布可以反映表面腐蝕氧化層的厚度，鈍化膜厚度約為20 nm。隨著濺射深度的變化，鈦元素的價態(tài)發(fā)生改變，表面層富集氧化態(tài)Ti4+，然后峰位偏移至Ti3+價態(tài)，緊接著是Ti2+，最終金屬態(tài)Ti0含量逐漸增加趨于穩(wěn)定。隨著濺射深度的增加，鈦元素含量由14 at.%逐漸增加至穩(wěn)定，氧元素含量由77 at.%逐漸降低，鈍化膜厚度增加至45 nm。可以發(fā)現(xiàn)相比于浸泡前的拋光樣品，浸泡后表面層聚集更多的氧化態(tài)Ti4+。

Ti-6Al-4V合金片在拋光后以及在細胞培養(yǎng)液中浸泡7 d后經(jīng)過XPS分析發(fā)現(xiàn)，隨著濺射深度的增加，Ti、Al、V元素含量逐漸增加至穩(wěn)定，氧元素含量逐漸降低，鈍化膜厚度約為18 nm。對拋光后樣品在不同濺射深度處獲得的Ti 2p、Al 2p、V 2p的XPS精細譜進行分峰擬合后的結果發(fā)現(xiàn)，其表面主要由氧化態(tài)Ti4+、Al3+以及少量V5+組成，隨著濺射深度增加，金屬態(tài)Ti0，Al0，V0出現(xiàn)，含量逐漸趨于穩(wěn)定。在細胞培養(yǎng)液中浸泡7 d后表面成分Ti、Al、V、O組元的鈍化膜厚度增加至49 nm左右。在不同濺射深度處獲得的Ti 2p、Al 2p、V 2p的XPS精細譜進行分峰擬合后的結果可以看出最外表面處主要由氧化態(tài)Ti4+，Al3+和少量V5+組成，隨著濺射深度的增加，金屬態(tài)Ti0，Al0，V0出現(xiàn)并且逐漸達到穩(wěn)定。與原始拋光后樣品相比，最外表面處富集更多的氧化態(tài)Ti4+和Al3+，說明Ti和Al元素優(yōu)先發(fā)生氧化以增厚鈍化膜從而保護合金基體。見圖3。

3 討論

生物材料的表面特性對其植入效果十分重要。生物材料植入體內后，首先是通過表面與體內環(huán)境（包括體液、細胞和組織）接觸，因此生物材料表面特性對其抗腐蝕性、早期植入效果、生物活性以及血液相容性等都有直接影響。對生物材料表面結構與組成進行深入分析有助于了解它們對植入體的影響及其作用過程，并為生物材料的表面改性提供理論指導。拋光后CPTi和Ti-6Al-4V合金初始表面膜主要由氧化態(tài)Ti4+組成，Ti-6Al-4V合金表面還含有少量氧化態(tài)Al3+和微量V5+，表面鈍化膜厚度為20 nm左右。細胞培養(yǎng)液浸泡后，表面膜的生成和合金元素的溶解過程同時發(fā)生，最終表面膜增厚以保護基體金屬。本實驗中XPS分析浸泡14 d后的CPTi和Ti-6Al-4V表面均有不同厚度的氧化膜生成，可以有效阻止金屬離子的析出，因此認為這兩種種植體合金材料的耐腐蝕性能幾乎沒有差別，都非常好。但是種植體植入體內后組織液中氧的濃度比空氣中差很多，因此氧化膜的厚度可能會減小，同時形成的時間會比較長。另外，本研究中使用的是細胞培養(yǎng)液，與真正植入體內后的骨組織中的組織液的浸泡還是有差別的，進一步的檢測還需要動物實驗來進行驗證。

Turpin等［7］發(fā)現(xiàn)浸泡前鈦金屬表面的氧化膜厚度約為30 nm，在酸性口腔液中浸泡后表面鈍化膜厚度有了明顯提高，主要是由鈦的各種氧化狀態(tài)組成，這與本結果接近。本研究使用的浸泡環(huán)境是高糖DMEM（加10%胎牛血清）中含有各種無機鹽離子（如 Cl-、PO43-）和有機物（如氨基酸和蛋白質）。蛋白質是一種球形的細胞外白蛋白，可與大多數(shù)固體表面發(fā)生強相互作用，金屬表面吸附蛋白質分子后，一方面阻礙Cl-離子侵蝕，另一方面也阻止氧在金屬表面的擴散，影響鈍化膜的形成。同時，蛋白質可以與金屬離子絡合，加速金屬離子的溶解，這3個方面相互制約導致金屬表面保護膜的形成與表面金屬離子溶解間的平衡。有文獻報道［8］在模擬體液中CPTi和Ti-6Al-4V合金均具有較好的耐蝕能力。

現(xiàn)有評價牙科合金細胞毒性的研究多數(shù)選擇的細胞分為兩種：（1）大鼠成纖維細胞（L929）［9］，這是ISO國際標準中指定的用于檢測材料毒性的細胞；（2）與種植體表面直接接觸的成骨細胞。目前使用的大多是小鼠成骨細胞（MC3T3）［10］和人骨肉瘤樣細胞（MG-63）［11］。但是，還有一類細胞與種植體的頸部有小面積的直接接觸，即人的牙齦上皮細胞，除此以外，還可以選用上皮細胞來研究種植體的細胞毒性。我們選用的HU在炎性反應中有著重要的作用，它可以分泌相關的細胞因子，表達與材料表面相互作用的黏附分子［12］，可以幫助我們從炎癥的角度來認識細胞與植入材料的相互作用。

綜上所述，本研究認為CPTi和Ti-6Al-4V的生物相容性沒有差別。Takemoto等［13］對CPTi和幾種新型鈦合金進行了細胞毒性的評估，將它們接種在3T3細胞上72 h，MTT結果未檢測到明顯的差異。因此認為，鈦合金在生物環(huán)境中可能存在低腐蝕，數(shù)量極少的金屬離子不足以引起明顯的毒性，而本研究中將細胞接種的最長時間延至14 d，細胞的增殖過程中已經(jīng)出現(xiàn)了一個峰值，然后逐漸降低，所得到的MTT結果仍顯示2種材料沒有統(tǒng)計學差異，同步的XPS結果觀察到CPTi和Ti-6Al-4V都有鈍化膜形成，也沒有看到點蝕情況的發(fā)生，這在一定程度上可以說明生長在材料表面的細胞的代謝活動對材料幾乎沒有腐蝕作用。但是人們對Ti-6Al-4V的離子釋放問題始終很擔憂，因此長期的腐蝕效果觀察還需要進一步的動物實驗。

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