李義剛，劉濱揚(yáng)，彭穎，廖偉，武小燕，蘇甜，歐瑞康，聶湘平

暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生態(tài)系水體富營(yíng)養(yǎng)化與赤潮防治廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510632

三氯生(2，4，4'-三氯-2'-羥基二苯醚，triclosan)是一種廣泛使用的廣譜抗菌劑，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母及病毒均有廣泛高效的殺滅及抑制作用。三氯生應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，包括醫(yī)藥、化妝品與洗滌劑等領(lǐng)域，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出200余種日化產(chǎn)品及專(zhuān)業(yè)新產(chǎn)品［1］。伴隨著各種醫(yī)藥、化妝品及洗滌劑用品的廣泛使用，三氯生排放進(jìn)入水體以及其他環(huán)境介質(zhì)中，甚至還可能進(jìn)入食物鏈，最后在植物、動(dòng)物和人體中蓄積［2-3］。周世兵等［4］報(bào)道在污水處理廠排污口附近水域能普遍檢出三氯生。Peng等［5］報(bào)道在珠江水域中檢測(cè)出三氯生的含量在35～1 023 ng·L-1之間。Coogan等［6］在北德克薩斯州某河流的藻類(lèi)中檢測(cè)到三氯生的富集含量達(dá)到50～400 ng·g-1(以鮮質(zhì)量計(jì));Adolfsson-Erici等［7］在人的奶汁中發(fā)現(xiàn)三氯生的質(zhì)量濃度為0．07～300 ng·g-1(以鮮質(zhì)量計(jì))。三氯生作為藥品與個(gè)人護(hù)理品中的添加物，在低濃度的情況下，毒性并不顯著，因此尚未得到足夠重視［4］，但是在一定條件下，三氯生可生成其他有毒中間產(chǎn)物。Milagros等［8］發(fā)現(xiàn)水中的三氯生在紫外線照射的條件下，會(huì)光解生產(chǎn)2，7/2，8-二氯二苯并-對(duì)-二惡英。二惡英是一類(lèi)強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，美國(guó)藥典對(duì)于三氯生中的二惡英含量規(guī)定不得大于 0．25mg·kg-1［9］。此外，三氯生可被自由氯離子氧化，生成氯仿、2，4，6-三氯苯酚等有毒化合物［10］。李林朋等［11］的研究表明，三氯生可導(dǎo)致人體正常干細(xì)胞的DNA斷裂損傷，且具有明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。Gee等［12］研究發(fā)現(xiàn)，三氯生可對(duì)人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生雌激素和雄激素效應(yīng)。大量文獻(xiàn)表明三氯生對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康具有不容忽視的潛在毒性效應(yīng)，開(kāi)展其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估非常必要。

藻類(lèi)作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，一般位于食物鏈的最底端，藻類(lèi)與其他水生生物的關(guān)系十分密切，它對(duì)維持水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定具有總要意義，所以藻類(lèi)是監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量的重要指示生物［13］。羊角月牙藻是淡水水體中常見(jiàn)的藻類(lèi)之一，其生長(zhǎng)速度快，便于觀測(cè)，已有研究證實(shí)其對(duì)環(huán)境條件變化及污染物很敏感，是水環(huán)境生態(tài)毒理學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)生物(ISO 8692-1989)。目前，對(duì)三氯生的研究大多集中在日化產(chǎn)品中其含量檢測(cè)方法的建立及其在廢水中含量的檢測(cè)［4，14］，國(guó)內(nèi)外只有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)生物的影響或毒性效應(yīng)［15-16］，然而關(guān)于三氯生對(duì)藻類(lèi)的光合作用以及抗氧化酶系影響方面目前還鮮見(jiàn)報(bào)道。

以羊角月牙藻為實(shí)驗(yàn)材料，從藻類(lèi)生長(zhǎng)速率、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)以及抗氧化酶系統(tǒng)等方面評(píng)價(jià)三氯生羊角月牙藻的毒性效應(yīng)，探究不同質(zhì)量濃度的三氯生暴露后藻類(lèi)的變化及其響應(yīng)規(guī)律，為進(jìn)一步研究和評(píng)價(jià)水體環(huán)境中三氯生的生態(tài)毒理效應(yīng)及其潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 儀器和試劑

儀器:冷凍高速離心機(jī)(sigma 2-16k，德國(guó));超低溫冰箱(Thermo forma，美國(guó));超聲波細(xì)胞粉碎儀(UH-950B，天津);恒溫水浴鍋(HH．S21-6，上海);超聲波清洗器(Branson 3510，美國(guó));顯微鏡(Olympus CX21，日本);計(jì)數(shù)器(KWTRIO，上海);烘箱(GZX-9076，上海);分析天平(PrecisaXS 125A-SCS，瑞士);自動(dòng)蒸汽滅菌鍋(D-1，上海);酸度計(jì)(BeckmanΦ350，美國(guó));三溫區(qū)光照培養(yǎng)箱(FPG3，寧波萊福);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(HachDR 5000，美國(guó))。

試劑:三氯生購(gòu)于北京百靈威科技有限公司，純度≥96%，藥品于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用蒸餾水配制成母液，母液濃度為5 mg·L-1。所用其他試劑均為分析純。

1．2 實(shí)驗(yàn)材料

藻種:羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)藻種由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)提供。藻種置于恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用AAM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每升培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［17］，光暗周期12 h∶12 h，于光照強(qiáng)度60 μmol·m-2·s-1，溫度(23 ±1)℃。每天人工搖動(dòng)3次，隔96 h移動(dòng)1次，反復(fù)3次以上，使之達(dá)到同步生長(zhǎng)。每次移動(dòng)前進(jìn)行顯微鏡境檢，檢查藻是否污染。

1．3 毒性實(shí)驗(yàn)

1．3．1 生物量測(cè)定

培養(yǎng)的藻液分別在0、24、48、72、96 h 取樣，通過(guò)在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)在波長(zhǎng)680 nm下測(cè)定的藻液光密度，建立不同藻細(xì)胞濃度和光密度之間的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)中以測(cè)定的光密度和根據(jù)線性方程計(jì)算出的藻細(xì)胞濃度表示細(xì)胞數(shù)。預(yù)實(shí)驗(yàn)在250mL錐形瓶中進(jìn)行，三氯生設(shè)置了5個(gè)間隔較大的濃度梯度(0．002、0．010、0．050、0．250、0．500 mg·L-1)和空白對(duì)照，每個(gè)濃度組設(shè)3 組平行，于0、24、48、72、96 h后定時(shí)取樣，測(cè)定680 nm波長(zhǎng)下各實(shí)驗(yàn)組藻液吸光值，用概率單位法計(jì)算96 h-EC50。

1．3．2 葉綠素a含量測(cè)定

參照王學(xué)奎的方法［18］，取經(jīng)過(guò)三氯生暴露處理0、24、48、72、96 h 后藻液，3 500 × g離心分離藻體細(xì)胞，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，振蕩搖勻，于黑暗處4℃下提取24 h。將提取液以7 000 r·min-1離心，取上清液，1 cm光徑比色皿，以體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇為空白，分別在470、663和645 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)公式葉綠素 a=13．95A663-6．88A645計(jì)算葉綠素 a［18］。

1．3．3 葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定

葉綠素?zé)晒饫弥参镄蕛x(PEA，Hansatech Ltd．，英國(guó))于室溫下測(cè)定。分別取不同處理濃度暴露96 h后樣品藻液，測(cè)試前藻液樣品暗適應(yīng)20min。

采用的參數(shù)及其計(jì)算方法見(jiàn)表1，葉綠素?zé)晒鈪?shù)的分析主要是根據(jù)Appenroth和Strasser的方法［19-20］。放氧復(fù)合體的比例按公式(1)與(2)進(jìn)行計(jì)算［23］。

1．4 酶活性的測(cè)定

三氯生在預(yù)實(shí)驗(yàn)中96 h內(nèi)使羊角月牙藻抑制率為100%的濃度為0．500 mg·L-1，急性毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照和5 個(gè)三氯生暴露組(0．000、0．004、0．016、0．064、0．128和0．256mg·L-1)。實(shí)驗(yàn)條件跟預(yù)實(shí)驗(yàn)相同。暴露96 h后，分別取100mL的藻液于3 500×g、4℃下離心10min，棄去上清液，藻泥冷凍在-80℃冰箱待測(cè)。

測(cè)定時(shí)將離心所得藻泥再懸浮于3．0 mL 0．1 mol·L-1(pH 7．8)的磷酸鹽緩沖液中，冰浴下超聲波不連續(xù)破碎30 min，其中破碎時(shí)間3 s，間隔時(shí)間7 s，超聲波破碎儀工作功率為15 W，破碎后于4℃、7 150×g下離心15 min，上清液為粗酶液，用于酶活性的測(cè)定。

蛋白含量、GSH含量、GST活性、MDA含量和CAT活性測(cè)定均采用南京建成生物公司的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。蛋白測(cè)定采用考馬斯亮蘭法，蛋白以樣品蛋白含量μg·mL-1表示。GSH含量在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度計(jì)算，GST活性以在37℃反應(yīng)1 min扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1μmol·L-1為1個(gè)酶活力單位(U)。MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法(TBA法)，以μmol·mg-1表示。CAT測(cè)定采用紫外吸收法，定義每毫克蛋白每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為1個(gè)活力單位(U)。GST、CAT的活性和GSH、MDA的含量均以每毫克蛋白含量為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，每個(gè)平行測(cè)定3次，取其平均值計(jì)算。

1．5 數(shù)據(jù)處理

同一處理時(shí)間的各指標(biāo)內(nèi)差異顯著性采用單因素方差分析(One-Way ANOVA，LSD)，分析軟件為SPSS 13．0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示，P＜0．05和 P＜0．01表示處理組與對(duì)照組差異顯著和極顯著。

表1 JIP-測(cè)定中快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(O-J-I-P)的參數(shù)Table 1 Parameters in analysis of O-J-I-P chlorophyll a fluorescence transients in JIP-test

2 結(jié)果(Results)

2．1 三氯生對(duì)羊角月牙藻的毒性實(shí)驗(yàn)

2．1．1 三氯生對(duì)羊角月牙藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖1可見(jiàn)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，除了高濃度組0．500 mg·L-1，各實(shí)驗(yàn)濃度組藻細(xì)胞密度均逐漸升高。但隨著三氯生濃度的升高，羊角月牙藻生長(zhǎng)受到抑制，藻細(xì)胞密度逐漸降低，并且二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，有比較明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。三氯生濃度為0．050 mg·L-1時(shí)，羊角月牙藻的生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制，當(dāng)三氯生濃度達(dá)到0．250 mg·L-1時(shí)，羊角月牙藻的生長(zhǎng)受到顯著抑制，藻細(xì)胞密度顯著下降。當(dāng)三氯生濃度達(dá)到0．500 mg·L-1時(shí)，藻細(xì)胞密度出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)部分藻細(xì)胞壁受到破壞，藻細(xì)胞的顏色變淺。計(jì)算三氯生對(duì)羊角月牙藻的96 h-EC50為 0．112 mg·L-1，按照水生生物毒性分級(jí)［21］，三氯生對(duì)羊角月牙藻的急性毒性屬于高毒。

圖1 三氯生對(duì)羊角月牙藻生長(zhǎng)的影響Fig．1 Effects of triclosan(TCS)on growth of S．capricornutum

圖2 三氯生對(duì)羊角月牙藻葉綠素a的影響Fig．2 Effects of TCS on chlorophyll a of S．capricornutum

2．1．2 三氯生對(duì)羊角月牙藻葉綠素a的影響

在不同濃度三氯生的處理下，羊角月牙藻葉綠素a含量的變化趨勢(shì)與細(xì)胞密度的變化趨勢(shì)基本吻合，隨著三氯生濃度的增大，培養(yǎng)液中的葉綠素a含量下降，96 h時(shí)0．500 mg·L-1處理組葉綠素含量為對(duì)照的14．6℅，48 h后開(kāi)始出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。

2．1．3 三氯生對(duì)羊角月牙藻葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)影響

由圖3可見(jiàn)，在藻細(xì)胞光合作用的PSII供體中，羊角月牙藻放氧復(fù)合體(OEC)比例隨著三氯生濃度的升高而出現(xiàn)了大幅度下降，三氯生濃度為0．064 mg·L-1時(shí)，羊角月牙藻的放氧復(fù)合體的比值為對(duì)照的72%，當(dāng)三氯生濃度達(dá)到0．256 mg·L-1時(shí)，羊角月牙藻的放氧復(fù)合體的比值還不及對(duì)照組的40%。

圖3 三氯生處理后羊角月牙藻放氧復(fù)合體比例的變化Fig．3 Changes of fraction of OEC in S．capricornutum after TCS treatment

由圖4可見(jiàn)，羊角月牙藻單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)隨著三氯生濃度的升高而出現(xiàn)大幅升高，單位面積反應(yīng)中心的數(shù)量(RC/CSo)出現(xiàn)明顯下降，單位反應(yīng)中心所捕獲的光能(TRo/RC)略有上升，但是用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(φEo)、最大光化學(xué)效率(φPo)、捕獲的激子能推動(dòng)電子傳遞的效率(ψo(hù))均有明顯下降，表明隨著三氯生濃度的升高，用于原初光化學(xué)反應(yīng)及電子傳遞的能量出現(xiàn)降低，多余的光能通過(guò)熱耗散的形式進(jìn)行釋放，從而導(dǎo)致用于熱耗散的量子產(chǎn)額(φDo)出現(xiàn)大幅升高，最終導(dǎo)致羊角月牙藻PSII性能指數(shù)(PIabs)大幅下降，當(dāng)三氯生暴露濃度為0．256 mg·L-1，羊角月牙藻(PIabs)還不及對(duì)照組的2%。

Mo、Sm、φEo和 ψo(hù)等參數(shù)主要反映 PSII受體側(cè)變化。PSII受體側(cè)主要包括QA、QB和PQ庫(kù)等。Mo反映了QA被還原的最大速率，即O-J過(guò)程中QA被還原的速率［20］，它與反應(yīng)中心色素、捕光色素和QA所處的狀態(tài)有關(guān);Sm則反映了QA完全被還原所需要的能量，即PSII反應(yīng)中心受體側(cè)PQ庫(kù)的大小［22］，電子從QA進(jìn)入電子傳遞鏈越多，則達(dá)到 FM所需要時(shí)間越長(zhǎng)，Sm的值也就越大。隨著三氯生濃度的增高，Sm出現(xiàn)下降，Mo上升，使得羊角月牙藻PSII受體側(cè)PQ庫(kù)變小，電子傳遞體數(shù)量減少，QA向下傳遞的電子受到抑制，加快了QA還原效率，減少了QA還原次數(shù)，即N變小。這表明，三氯生使羊角月牙藻的PSII反應(yīng)中心受損，抑制了光合作用的原初反應(yīng)，阻礙了光合電子傳遞的過(guò)程。

圖4 三氯生處理后羊角月牙藻光合作用各動(dòng)力學(xué)JIP-測(cè)定參數(shù)的變化Fig．4 Changes of selected JIP-test parameters for S．capricornutum after TCS treatment

2．2 三氯生對(duì)羊角月牙藻GSH和MDA含量與GST和CAT酶活性的影響

由圖5可見(jiàn)，隨著三氯生濃度的增加，GST和CAT活性均呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的現(xiàn)象。GST在濃度組 0．128 mg·L–1中受到極顯著誘導(dǎo)(P ＜0．01)，當(dāng)三氯生濃度為0．256 mg·L-1時(shí)，GST活性為對(duì)照組的1．7 倍，差異不顯著(P ＞0．05)。在暴露組0．064 mg·L–1中CAT 受到顯著誘導(dǎo)(P ＜0．05)，當(dāng)暴露濃度達(dá)到0．128mg·L-1時(shí)，CAT 含量為對(duì)照組的2．18 倍，受到極顯著誘導(dǎo)(P＜0．01)，CAT活性在高濃度組0．256 mg·L-1中為對(duì)照組的1．3 倍，差異不顯著(P ＞0．05)。

圖5 三氯生對(duì)羊角月牙藻CAT、GST活性與GSH、MDA含量的影響

三氯生對(duì)羊角月牙藻GSH的影響不大，其含量總體升高，只在濃度組0．128mg·L–1中受到顯著誘導(dǎo)(P＜0．05)。三氯生對(duì)羊角月牙藻MDA含量呈現(xiàn)誘導(dǎo)的現(xiàn)象，在低濃度組(0．004、0．016 mg·L–1)中，MDA含量跟對(duì)照組相差不大，隨著三氯生濃度的增加，MDA含量逐漸增加，在三氯生濃度為0．064和0．128 mg·L–1時(shí)，MDA 受到顯著誘導(dǎo)(P ＜0．05)，當(dāng)三氯生濃度達(dá)到0．256 mg·L-1時(shí)，MDA含量為對(duì)照組的1．81 倍，達(dá)到最大，受到極顯著誘導(dǎo)(P ＜0．01)。

3 討論(Discussion)

3．1 三氯生對(duì)羊角月牙藻生長(zhǎng)和葉綠素a的影響

在低濃度三氯生暴露時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，羊角月牙藻在96 h表現(xiàn)出對(duì)三氯生的逐漸適應(yīng)，生長(zhǎng)速度雖然不及對(duì)照組，但仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。隨著三氯生暴露濃度的增大，藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。高濃度三氯生暴露可能對(duì)羊角月牙藻光合作用等關(guān)鍵代謝過(guò)程產(chǎn)生了干擾，從而影響了藻的代謝和繁殖，導(dǎo)致藻的生長(zhǎng)受到抑制［23］。三氯生對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響首先體現(xiàn)在對(duì)羊角月牙藻葉綠素a含量的影響。在三氯生暴露濃度較低時(shí)，葉綠素a含量穩(wěn)定增加，但高濃度的三氯生破壞了藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使得葉綠素含量降低，藻液顏色變黃等現(xiàn)象，可能是高濃度的三氯生引起了藻細(xì)胞膜系統(tǒng)脂質(zhì)過(guò)氧化而破壞了細(xì)胞和葉綠體等細(xì)胞器膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致葉綠素合成受阻［24］。

3．2 三氯生對(duì)羊角月牙藻葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)影響

植物在進(jìn)行光合作用時(shí)，葉綠素吸收的光能主要用于推動(dòng)光合作用，當(dāng)中也有一部分在形成同化力之前以熱的形式耗散或以熒光的形式重新發(fā)射出去［25］。在正常情況下，用來(lái)進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)的能量占葉綠素吸收光能的大部分，僅有少部分以熱或熒光的形式耗散掉。但是當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，植物的光反應(yīng)能力將下降，而熱耗散和葉綠素?zé)晒庑问降暮纳⒃黾?，因此，葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的變化過(guò)程可以用來(lái)反映植物受到環(huán)境脅迫的情況。

三氯生暴露使羊角月牙藻 RC/CSo、φPo、Sm、OEC和PIabs等指數(shù)大幅下降，表明了三氯生使羊角月牙藻的PSII反應(yīng)中心受損，抑制了光合作用的原初反應(yīng)，阻礙了光合電子傳遞的過(guò)程。這與紅霉素對(duì)羊角月牙藻的的作用機(jī)制類(lèi)似［17］。Ricart等［26］發(fā)現(xiàn)，三氯生會(huì)對(duì)藻類(lèi)光合作用系統(tǒng)產(chǎn)生損害，藻類(lèi)光合作用效率降低是藻類(lèi)光合作用系統(tǒng)結(jié)構(gòu)水平上受到損害的前兆。脂質(zhì)不僅是復(fù)合體上內(nèi)囊體基質(zhì)的主要組成部分，同時(shí)也是PSII在裝配和修復(fù)過(guò)程中的重要組成部分［27］。三氯生可通過(guò)抑制?；d體蛋白還原酶從而抑制脂肪酸的形成，進(jìn)而抑制脂質(zhì)的形成。脂質(zhì)合成的受阻會(huì)導(dǎo)致PSII反應(yīng)中心功能受阻，從而使原初光化學(xué)反應(yīng)等重要過(guò)程無(wú)法完成，因此，RC/CSo和φPo等指標(biāo)大幅下降。Kanervo等［28］發(fā)現(xiàn)D1蛋白的功能取決于內(nèi)囊體膜上脂質(zhì)的不飽和程度，而參與構(gòu)成PSII反應(yīng)中心的D1蛋白，是維持QB蛋白穩(wěn)定的重要因素之一［29］，由于三氯生暴露使D1蛋白合成受阻，導(dǎo)致QB易于從類(lèi)囊體膜上脫落，使PSII受體庫(kù)減小，Sm下降。此外，PSII反應(yīng)中心的受損，也影響到了OEC的正常組裝，使OEC的比例大幅下降，繼而影響水的光解。

3．3 三氯生對(duì)羊角月牙藻抗氧化酶系的影響

GST具有消除體內(nèi)自由基和解毒雙重功能，是一種重要的解毒酶，能催化內(nèi)源小分子GSH與許多次級(jí)底物結(jié)合，包括脂質(zhì)過(guò)氧化的次級(jí)產(chǎn)物，從而解除外源性污染物的毒性［30］。實(shí)驗(yàn)表明，隨三氯生暴露濃度增加，羊角月牙藻體內(nèi)的GST活性也呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。GST的活性與外源化合物的解毒和排除密切相關(guān)，GST活性的升高是生物體抵御外源污染物的一種應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。這可能與生物在外源污染物脅迫下產(chǎn)生活性氧自由基有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，三氯生暴露可顯著誘導(dǎo)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和積累［31］。本研究中MDA的持續(xù)升高也間接印證了三氯生引起了藻類(lèi)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，隨著自由基的積累從而誘導(dǎo)GST活性升高;但隨著三氯生暴露濃度的持續(xù)增加，高于 0．128 mg·L–1時(shí)，GST 的誘導(dǎo)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于過(guò)高濃度三氯生造成大量自由基產(chǎn)生并在體內(nèi)積累，抑制了GST酶的活性，這種GST活性在低濃度污染物暴露呈現(xiàn)誘導(dǎo)而高濃度暴露下降的變化在許多水生生物對(duì)污染物的暴露中均有報(bào)道［32-36］。

CAT是植物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，能催化H2O2生成H2O與O2，以減輕H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。在低濃度的三氯生暴露下，羊角月牙藻體內(nèi)的CAT活性受到明顯的誘導(dǎo)，并且隨著三氯生濃度的增大而升高。這說(shuō)明此時(shí)三氯生的暴露已經(jīng)對(duì)羊角月牙藻產(chǎn)生了氧化脅迫作用，誘導(dǎo)抗氧化酶活性的啟動(dòng)。隨著三氯生濃度繼續(xù)增加，超過(guò)了藻細(xì)胞的耐受極限，從而使CAT活性下降，羊角月牙藻生長(zhǎng)受到明顯抑制。Canesi等［37］研究發(fā)現(xiàn)，三氯生暴露導(dǎo)致地中海貽貝的消化腺CAT活性急劇下降，其可能原因是三氯生會(huì)影響酶參與維護(hù)生物機(jī)體的氧化還原平衡。CAT的下降反映出為抵御外源親電基團(tuán)的氧化，細(xì)胞體內(nèi)需要消耗還原性物質(zhì)同時(shí)抗氧化酶活性下降，并伴隨氧化產(chǎn)物MDA含量逐漸增加，也間接地反映出細(xì)胞損傷的程度［38］。

GSH是生物體內(nèi)重要的非酶系抗氧化系統(tǒng)的成分，其既可由于污染物的暴露而產(chǎn)生適應(yīng)性誘導(dǎo)反應(yīng)［39］，也可由于污染物的毒性作用大量耗竭，導(dǎo)致生物體內(nèi)GSH含量降低［40-41］。三氯生對(duì)羊角月牙藻體內(nèi)的GSH的合成無(wú)直接抑制效應(yīng)，羊角月牙藻經(jīng)過(guò)96 h的暴露，GSH含量總體處于被誘導(dǎo)狀態(tài)，但當(dāng)三氯生濃度達(dá)到 0．256 mg·L–1時(shí)，GSH 含量并沒(méi)有顯著增加。在蛋白核小球藻受到諾氟沙星藥物暴露過(guò)程中的GSH含量變化也有類(lèi)似表現(xiàn)［42］。這可能和藻類(lèi)體內(nèi)還存在其他可猝滅氧化自由基的還原性小分子(如抗壞血酸等)有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有同時(shí)測(cè)定其他還原性小分子變化，所有不能解釋GSH相對(duì)穩(wěn)定的變化原因，這需要在今后的工作中進(jìn)一步深入研究和探討。

MDA含量的上升指示了膜脂質(zhì)過(guò)氧化以及氧化脅迫的存在。膜脂質(zhì)過(guò)氧化由ROS引發(fā)并嚴(yán)重影響生物膜的功能及完整性，并對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷［43］。本研究中，三氯生為光合作用抑制劑，它們可以阻斷羊角月牙藻PSII電子傳遞，使處于激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)槿€態(tài)葉綠素，進(jìn)而促使 O2轉(zhuǎn)變?yōu)?ROS，從而導(dǎo)致氧化脅迫的產(chǎn)生［44］，這一點(diǎn)也可從本實(shí)驗(yàn)中3種抗生素導(dǎo)致羊角月牙藻MDA含量的顯著上升予以證明。

綜上所述，三氯生對(duì)羊角月牙藻96 h-EC50為0．112 mg·L-1，對(duì)羊角月牙藻屬于高毒物質(zhì)。三氯生對(duì)羊角月牙藻葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)ABS/RC、PIabs、RC/CSo和OEC比例等參數(shù)變化比較敏感。隨著三氯生濃度的增大，羊角月牙藻的葉綠素?zé)晒庵蠥BS/RC大幅上升，PI-abs、RC/CSo和OEC的比例下降，當(dāng)三氯生濃度為0．256mg·L-1時(shí)，ABS/RC 達(dá)到最大值，PIabs、RC/CSo和OEC比例下降為最小值，表明藻細(xì)胞光合作用的原初反應(yīng)及電子鏈傳遞過(guò)程受到嚴(yán)重阻礙。三氯生對(duì)羊角月牙藻體內(nèi)抗氧化酶系中GST活性和MDA也有較大影響。在低濃度暴露下，GST活性隨TCS濃度增加而增大，但當(dāng)TCS濃度超過(guò)0．256 mg·L-1時(shí)，GST 活性出現(xiàn)顯著下降，同時(shí)MDA的含量達(dá)到最大，這種GST活性的下降同時(shí)伴隨MDA含量的增加表明，藻細(xì)胞膜系統(tǒng)受到較大損害。因此，光合作用過(guò)程葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，如 ABS/RC、PIabs、RC/CSo和 OEC，以及抗氧化酶系統(tǒng)中GST和MDA可以作為有效的指標(biāo)參數(shù)用于三氯生的毒性的評(píng)價(jià)。

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