樓宏銘 李秀麗 王夢霞 邱學(xué)青? 楊東杰 鄧永紅

(1.華南理工大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，廣東 廣州 510640;2.華南理工大學(xué) 制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東 廣州 510640)

隨著資源和環(huán)境問題的日益嚴重，越來越多的人將注意力集中在清潔能源的開發(fā)上.地球上每年植物光合作用的生物量可達2000 億噸，其中大部分為木質(zhì)纖維素類.由于其可再生性和廣泛性，木質(zhì)纖維素受到越來越多學(xué)者的關(guān)注［1］.木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大部分組成，其中含量占到65%～75%的纖維素和半纖維素可以酶解而生成可發(fā)酵糖，進而發(fā)酵得到乙醇［2］.

木質(zhì)纖維素的酶解是一個非常復(fù)雜的過程，受到很多因素的影響.首先，木質(zhì)纖維素的頑抗性是影響其高效酶解的重要因素之一，因此目前很多研究都是將木質(zhì)纖維素進行物理或化學(xué)預(yù)處理，期望將木質(zhì)纖維素的三大組成部分分離開或是盡量降低木質(zhì)素的含量［3］，從而促進纖維素酶在纖維素上的吸附，提高酶解效率，并減少酶的用量，降低生產(chǎn)成本［4］.其次，木質(zhì)素對木質(zhì)纖維素的酶解過程有一定的阻礙作用，主要體現(xiàn)在兩個方面:空間位阻效應(yīng)以及對纖維素酶的無效吸附［5］.由于通過預(yù)處理去除木質(zhì)素來消除木質(zhì)素對纖維素酶解過程帶來的空間位阻效應(yīng)的經(jīng)濟成本很高［3］，且木質(zhì)素的完全去除是不太可能的.纖維素酶在木質(zhì)素上的無效吸附不可避免，因此可行的辦法是減少纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附.

減少纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附的方法有很多種，如添加表面活性劑、蛋白質(zhì)和聚合物等.但是由于這些化學(xué)試劑成本較高，在大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中受到一定的限制.也有很多的學(xué)者將注意力集中于提高纖維素酶的回收利用，以降低木質(zhì)纖維素的酶解成本.有學(xué)者通過在酶解液中加入Span 80、Tween 80 和Tween 20 等來提高纖維素酶的回收率或加入新鮮的木質(zhì)纖維素來吸附并回收纖維素酶［9-10］.同時，超濾法也被用于纖維素酶的回收利用［11］，該方法幾乎可以回收全部游離的纖維素酶.但是以上方法都需要投入較高的成本.

石英晶體微天平(QCM-D)已被用于研究纖維素酶、蛋白質(zhì)等在木質(zhì)纖維素薄膜和纖維素薄膜上的吸附［6-9］.文中通過QCM-D 研究不同pH 值下纖維素酶在木質(zhì)素薄膜上的吸附和脫附情況.

1 實驗方法

1.1 主要試劑

醋酸鈉緩沖液的離子強度為50 mmol/L，pH 值分別為4.8、5.5、6.0;麥草堿木質(zhì)素經(jīng)過堿溶(pH=12)后超濾，再酸析(pH=2)水洗得到相對分子質(zhì)量大于30000 的產(chǎn)品;實驗所用纖維素酶(CTec2)是木霉屬工業(yè)用纖維素酶，由諾維信公司提供，根據(jù)文獻［12］中的方法測得的酶活為147FPU/g glucan，蛋白質(zhì)含量為73.6 g/L.實驗中所用的CTec2 溶液的酶蛋白含量為100 mg/L.

1.2 麥草堿木質(zhì)素薄膜的制備

采用旋涂法制備麥草堿木質(zhì)素薄膜.旋涂儀型號為WS-400Bz-6NPP-LITE (邁可諾公司，中國).首先用0.75 mol/L 的氨水溶液溶解麥草堿木質(zhì)素［13］，并攪拌24 h，10 000 r/min 離心5 min，得到質(zhì)量分數(shù)為2%的麥草堿木質(zhì)素溶液.旋涂儀設(shè)置的轉(zhuǎn)速為2000 r/min，旋涂時間為60 s.

1.3 Zeta 電位測定

將pH=4.8、5.5、6.0 的CTec2 溶液分別注入電泳池中，測定Zeta 電位，殘差保持在0.05 以下，測定4 次取均值.

1.4 QCM-D 分析

實驗采用金片，使用前用氨水(25%)、過氧化氫(30%)和純水質(zhì)量比為1∶1∶5 的混合液在75 ℃下處理5 min.QCM-D(Q-Sense 501 型，瑞典)為單通道流通池，蠕動泵流率控制在0.100 mL/min.

晶體石英微天平可以感測到十分微小的質(zhì)量變化，它測得的質(zhì)量和頻率的變化成反比，耗散因子(D)與薄膜的剛?cè)嵝猿烧?，也就是說，耗散因子越大，薄膜的柔性就越大，吸附薄膜就越疏松.由于第三倍頻的穩(wěn)定性，實驗所采用的數(shù)據(jù)均為第三倍頻的數(shù)據(jù).

實驗過程中，先用不同pH 值的醋酸鈉緩沖液進行吸附試驗(基線)，而且必須在吸附平衡后才能進樣.等待吸附平穩(wěn)后，用纖維素酶溶液進行吸附測試.纖維素酶的吸附實驗采用靜態(tài)吸附模式，也就是當QCM-D 的流通池內(nèi)充滿CTec2 溶液后停止蠕動泵.而脫附實驗采用的是動態(tài)模式，也就是實驗過程中一直保持蠕動泵的運轉(zhuǎn)狀態(tài).

1.5 原子力顯微鏡(AFM)分析

測試儀器為韓國PARK 公司生產(chǎn)的XE-100 型原子力顯微鏡.選用NCHR 探針，設(shè)置掃描分辨率為512 ×512 像素，掃描頻率為1Hz，設(shè)置掃描模式為非接觸模式，掃描得麥草堿木質(zhì)素薄膜的表面形貌.測試的溫度設(shè)置為25 ℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 麥草堿木質(zhì)素薄膜的穩(wěn)定性

CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附實驗必須在緩沖液吸附(基線)達到平衡以后才能進行，所以，必須保證制得的麥草堿木質(zhì)素薄膜的穩(wěn)定性.圖1(a)所示是醋酸鈉緩沖液吸附的階段，從圖中可以看出，吸附量(-ΔF3)和耗散因子(ΔD3)在300 s 以后幾乎沒有發(fā)生變化，說明麥草堿木質(zhì)素薄膜沒有發(fā)生脫附現(xiàn)象，并且圖中顯示兩次實驗具良好的重復(fù)性，再次說明所制得的麥草堿木質(zhì)素薄膜穩(wěn)定.而緩沖液吸附的過程(如圖1(b)所示)可以分為3 個階段:(1)ΔF3和ΔD3接近于零，在這個階段，引起ΔF3和ΔD3變化的是管路中的空氣在木質(zhì)素薄膜上的吸附;(2)緩沖液進入流通池，與麥草堿木質(zhì)素發(fā)生接觸，使麥草堿木質(zhì)素薄膜發(fā)生快速溶脹，所以ΔF3和ΔD3的變化都很大;(3)醋酸鈉緩沖液充滿整個流通池，麥草堿木質(zhì)素薄膜充分溶脹，以至于ΔF3和ΔD3的變化很小，說明此時木質(zhì)素薄膜已達到穩(wěn)定的溶脹狀態(tài).

原子力顯微鏡掃描圖(圖1(c))顯示，在用緩沖液吸附前后，麥草堿木質(zhì)素薄膜的表面粗糙度分別為0.894 和0.842 nm.從麥草堿木質(zhì)素的表面形貌以及粗糙度的變化來看，麥草堿木質(zhì)素薄膜在實驗過程中表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，從而保證了實驗的順利進行.

2.2 纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素上的吸附形態(tài)

為了研究CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附形態(tài)，在緩沖液的吸附達到平衡后，測定CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上吸附和脫附時ΔF3和ΔD3的變化，如圖2 所示.其中，CTec2 溶液用pH =5.5、離子強度為50 mmol/L 的醋酸鈉緩沖液配制.從圖中可以看出，CTec2 在麥草堿木質(zhì)素上的吸附階段，耗散因子(ΔD3)隨CTec2 的吸附量(-ΔF3)的增大而增大，說明麥草堿木質(zhì)素薄膜在吸附上CTec2 后，膜的柔性或者厚度明顯增大，當CTec2 的吸附達到平衡后，ΔF3和ΔD3不再發(fā)生變化.從CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的脫附過程來看，ΔD3隨ΔF3的變化更加明顯，但是在脫附完成時，ΔF3并沒有達到CTec2的脫附初始值，說明CTec2 并沒有完全脫附，也就是說吸附在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的CTec2 有可逆吸附和不可逆吸附之分.所以，從纖維素回收的角度來看，增大纖維素酶在木質(zhì)素上的可逆吸附有利于提高纖維素酶的回收率，降低木質(zhì)纖維素的酶解成本.

圖1 醋酸鈉緩沖液(pH =4.8，離子強度為50 mmol/L)吸附平衡后，麥草堿木質(zhì)素薄膜的變化Fig.1 Film change of wheat straw alkaline lignin after the adsorption equilibrium in sodium acetate solution with a pH value of 4.8 and an ionic strength of 50 mmol/L

圖2 CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附引起的ΔF3和ΔD3的變化Fig.2 Change of ΔF3and ΔD3 induced by the adsorption of CTec2 on wheat straw alkaline lignin film

2.3 pH 值對纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素薄膜上吸附的影響

用Zeta 電位測得CTec2 的等電點pI 值為4.37，所以在pH =4.8，5.5，6.0 時，CTec2 會帶負電，且pH 值越高，CTec2 所帶的負電荷越多.而木質(zhì)素在所討論的pH 值下也是帶負電的.實驗測得pH =4.8，5.5，6.0 時，CTec2 的蛋白含量為100 mg/L 時的Zeta 電位分別為(-5.85 ±0.23)、(-8.26 ±0.34)、(-10.47 ±0.30)mV.所以，在pH =4.8 時CTec2 與木質(zhì)素之間存在靜電斥力，在pH =5.5 以及更高的pH 值時CTec2 與木質(zhì)素之間存在的靜電斥力更大.因此，在較低的pH 值下，CTec2 在麥草堿木質(zhì)素上的吸附量較大，如圖3(a)所示.

如圖3(b)所示，不同的pH 值下，CTec2 在木質(zhì)素上吸附的ΔF3、ΔD3關(guān)系圖的斜率有很大的不同，pH 值越高斜率越大.ΔD3-ΔF3曲線的斜率通常用來表征吸附膜的粘彈性，這與吸附的分子的結(jié)構(gòu)以及構(gòu)象有密切的聯(lián)系.pH 值越高，CTec2 與木質(zhì)素之間的靜電斥力越大，也就使得CTec2 在麥草堿木質(zhì)素表面形成的吸附膜越疏松，從而表現(xiàn)出更大的粘彈性.圖3(b)結(jié)果表明，當纖維素酶的量一定時，減少纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附可以增大其在纖維素上的吸附量，從而提高木質(zhì)素纖維素的酶解效率.Lou 等［14-15］的研究發(fā)現(xiàn)，在較高的pH 值下，木質(zhì)纖維素的酶解效率明顯提高，原因可能是因為較高的pH 值下纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附減少，而本實驗結(jié)果恰好證實了這一點.

圖3 pH 值為4.8、5.5 和6.0 時CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附Fig.3 Adsorption of CTec2 on wheat straw alkaline lignin film at the pH values of 4.8、5.5 and 6.0

2.4 pH 值對纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素薄膜上脫附的影響

離子強度為50 mmol/L 時，pH 值對CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的脫附的影響如表1 所示.從表1 中可以看出，在相同的pH 值下吸附后再用不同pH 值的醋酸鈉緩沖液進行脫附，脫附pH 值越高，CTec2 的脫附量越大，CTec2 的可逆吸附部分占全部吸附量的比例也越大.因為在較高的pH 值下，CTec2 與麥草堿木質(zhì)素之間的靜電斥力較大，而且CTec2 在麥草堿木質(zhì)素上形成的吸附膜更為疏松，粘彈性更大，所以使得CTec2 更容易從麥草堿木質(zhì)素薄膜上脫附下來.因此，可利用纖維素酶在較高的pH 值下較易脫附的特點來回收纖維素酶，增大纖維素酶的利用率，并降低成本.

表1 離子強度為50 mmol/L 時，pH 值對CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上脫附的影響Table 1 Effect of pH value on the desorption of CTec2 on wheat straw alkaline lignin when the ionic strength of buffer is 50 mmol/L

3 結(jié)論

用旋涂法制得的麥草堿木質(zhì)素薄膜平滑而且穩(wěn)定性很好，可用于研究CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附和脫附情況.纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素上的吸附存在可逆吸附和不可逆吸附之分.在較高的pH 值下，纖維素酶與麥草堿木質(zhì)素之間的靜電斥力較大，形成的吸附膜較為疏松，纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附量較少，有利于提高木質(zhì)纖維素的酶解效率.同時，較高的pH 值下，纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附變得不牢固，可逆吸附部分的纖維素酶增多，從而會有更多的纖維素酶從麥草木質(zhì)素薄膜上脫附下來，提高纖維素的回收利用率.

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