賴(lài)賽麟 李海成 王威 孫毅凡 郭卉欣 陳濤 江勇 錢(qián)明 江振友 周琳 鐘球

·短篇 論著·

熱滅活和紫外線(xiàn)照射滅活結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)效果分析

賴(lài)賽麟 李海成 王威 孫毅凡 郭卉欣 陳濤 江勇 錢(qián)明 江振友 周琳 鐘球

我國(guó)衛(wèi)生部公布的《人間傳染的病原微生物名錄》中結(jié)核分枝桿菌被列為第二類(lèi)病原微生物（危害程度為Ⅲ級(jí)），屬高致病性病原微生物［1］。實(shí)驗(yàn)室研究課題中，大部分涉及到結(jié)核分枝桿菌的操作，實(shí)驗(yàn)室生物安全是首先要解決的問(wèn)題。至今，已有一些關(guān)于實(shí)驗(yàn)室工作人員患結(jié)核病的報(bào)道，其中呼吸道吸入感染是實(shí)驗(yàn)室感染的最主要類(lèi)型［2］。根據(jù)傳染病發(fā)生必須存在的3個(gè)條件：傳染源、傳播途徑和易感者。在實(shí)驗(yàn)操作中如果做好傳染源的控制，如避免產(chǎn)生活菌氣溶膠、有效滅活細(xì)菌等，實(shí)驗(yàn)室生物安全就有了最根本的保障。本實(shí)驗(yàn)探討了實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌傳染源控制中的熱滅活和紫外線(xiàn)照射滅活方法的效果，為保障生物安全提供參考依據(jù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)菌株：6株結(jié)核分枝桿菌：BCG：牛結(jié)核分枝桿菌；H37Ra：結(jié)核分枝桿菌減毒株；H37Rv：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株；Se：臨床分離敏感菌株；MDR：臨床分離耐多藥菌株；XDR：臨床分離廣泛耐藥菌株。上述菌株均由廣東省結(jié)核病控制中心提供，均已經(jīng)過(guò)對(duì)硝基苯甲酸（PNB）、噻吩-2-羧酸肼（TCH）鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行菌群初篩鑒定為結(jié)核分枝桿菌，并經(jīng)過(guò)了基因分型鑒定和藥敏鑒定為相應(yīng)菌株。

2.改良羅氏固體培養(yǎng)基：由廣東省結(jié)核病控制中心制作提供。

3.比濁儀：法國(guó)bioMérieux（生物梅里埃）公司生產(chǎn)的DensiCHEK Plus比濁儀。

4.生物安全柜：新加坡Esco公司生產(chǎn)的Labculture 2級(jí)生物安全柜。

5.電熱儀：杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)的干式恒溫器。

6.紫外線(xiàn)燈：新加坡Esco Labculture 2級(jí)生物安全柜內(nèi)置30 W紫外線(xiàn)燈，距離工作臺(tái)面約70 cm，壽命在有效期內(nèi)，使用前已用75%乙醇紗布擦拭清潔。

7.37 ℃培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司生產(chǎn)的LRH系列生化培養(yǎng)箱。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.制備菌懸液：6株細(xì)菌已在改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)5周，用接種環(huán)分別刮取菌株純培養(yǎng)物至6個(gè)磨菌器中，用巴氏管加入無(wú)菌10%吐溫-80的水溶液3滴，研磨后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋?zhuān)D(zhuǎn)移至一塑料試管經(jīng)比濁儀測(cè)量，根據(jù)讀數(shù)稀釋為100mg/ml，其余兩個(gè)濃度為10-1mg/ml、10-2mg/ml菌懸液在此基礎(chǔ)上依次加PBS稀釋制備。

2.加熱滅活：實(shí)驗(yàn)在Esco Labculture 2級(jí)生物安全柜中操作。吸取菌懸液1 ml至有螺紋蓋的2 ml離心管（EP管）中，轉(zhuǎn)移至已設(shè)好溫度的電熱儀孔中，加熱至不同時(shí)間取出，立即將處理后的菌懸液用10μl標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)各接種3環(huán)到2個(gè)改良羅氏固體培養(yǎng)基斜面，設(shè)立PBS陰性對(duì)照，培養(yǎng)基空白對(duì)照和各菌懸液陽(yáng)性對(duì)照，放37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8周，實(shí)驗(yàn)按菌液濃度分批進(jìn)行。

3.紫外線(xiàn)照射滅活：實(shí)驗(yàn)在Esco Labculture 2級(jí)生物安全柜中操作，BSL-2負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫度為22℃，相對(duì)濕度為24%。吸取各菌株的菌懸液各1 ml至6孔培養(yǎng)板，開(kāi)蓋置安全柜內(nèi)置的紫外線(xiàn)燈下，垂直距離70 cm，照射至不同時(shí)間終止照射，將照射后的菌懸液用10μl標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)各接種3環(huán)到2支改良羅氏固體培養(yǎng)基斜面，設(shè)立PBS陰性對(duì)照，培養(yǎng)基空白對(duì)照和各菌懸液陽(yáng)性對(duì)照，放37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8周，實(shí)驗(yàn)按菌液濃度分批進(jìn)行。

4.結(jié)果觀(guān)察記錄：在經(jīng)滅活處理后培養(yǎng)的第4周，觀(guān)察記錄培養(yǎng)基斜面的殘存菌落生長(zhǎng)情況，第8周觀(guān)察記錄陰性結(jié)果：（1）無(wú)菌落生長(zhǎng)記錄為“-”。（2）菌落數(shù)≤50個(gè)記錄實(shí)際菌落數(shù)。（3）菌落數(shù)＞50個(gè)，生長(zhǎng)面積≤1/4記錄為“十”；1/4＜生長(zhǎng)面積≤1/2記錄為“十十”；1/2＜生長(zhǎng)面積≤3/4記錄為“十十十”；生長(zhǎng)面積＞3/4記錄為“十十十十”［3］。記錄結(jié)果為2支羅氏培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)菌落的平均值。

結(jié) 果

一、熱滅活

6株菌株3個(gè)菌液濃度的陽(yáng)性對(duì)照均有大量菌落生長(zhǎng)，PBS陰性對(duì)照及羅氏培養(yǎng)基空白對(duì)照均沒(méi)有菌落生長(zhǎng)。在加熱溫度、時(shí)間相同的條件下，隨著滅活對(duì)象菌懸液濃度的增大，細(xì)菌的殘存數(shù)呈增多趨勢(shì)；在菌液濃度、加熱時(shí)間相同的情況下，隨著加熱溫度的增大，細(xì)菌的殘存數(shù)呈減少趨勢(shì)；在菌液濃度、加熱溫度相同的條件下，隨著加熱時(shí)間的增加，細(xì)菌的殘存數(shù)呈減少趨勢(shì)。在溫度≥80℃，加熱時(shí)間≥10 min的條件下，6株菌株10-2、10-1、100mg/ml 3個(gè)濃度1 ml菌懸液里的細(xì)菌可以被有效滅活（表1）。

表1 不同加熱時(shí)間各菌株10-2、10-1、100mg/ml 3個(gè)菌液濃度1 ml菌懸液經(jīng)不同溫度熱滅活的結(jié)果

二、紫外線(xiàn)照射滅活

6株菌株3個(gè)菌液濃度的陽(yáng)性對(duì)照均有大量菌落生長(zhǎng)，PBS陰性對(duì)照及羅氏培養(yǎng)基空白對(duì)照均沒(méi)有菌落生長(zhǎng)。在紫外線(xiàn)照射距離、照射時(shí)間相同的條件下，隨著菌液濃度的增大，細(xì)菌的殘存數(shù)呈增加的趨勢(shì)；在紫外線(xiàn)照射距離、菌液濃度相同的條件下，隨著照射時(shí)間的增加，細(xì)菌的殘存數(shù)呈減少的趨勢(shì)；在照射距離為70 cm，照射時(shí)間≥40 min的條件下，6株菌株10-2、10-1、100mg/ml 3個(gè)菌液濃度1 ml菌懸液里的細(xì)菌可以被紫外線(xiàn)有效滅活（表2）。

表2 不同菌株10-2、10-1、100mg/ml 3種菌液濃度1 ml菌懸液經(jīng)紫外線(xiàn)照射的滅活結(jié)果

討 論

首先，本滅活實(shí)驗(yàn)研究中同時(shí)設(shè)立的6株菌株3個(gè)菌液濃度的陽(yáng)性對(duì)照均有大量菌落生長(zhǎng)，PBS陰性對(duì)照及羅氏培養(yǎng)基空白對(duì)照均沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確地反映滅活處理的效果。

一、關(guān)于影響熱滅活結(jié)核分枝桿菌效果的因素分析

在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)水平的實(shí)驗(yàn)操作前，如菌種分子鑒定、基因分型及耐藥基因分析等，必須先對(duì)培養(yǎng)物或臨床樣本進(jìn)行確切滅活。目前的滅活方法主要是熱滅活法，但溫度和時(shí)間各不相同，最常見(jiàn)的方案是80℃，滅菌30 min［3］，但也有文獻(xiàn)指出這個(gè)簡(jiǎn)單的80℃滅活方案的重復(fù)性依然有爭(zhēng)議［4］。本次熱滅活實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了溫度梯度、時(shí)間梯度和菌液濃度梯度進(jìn)行了探討，從表1的結(jié)果數(shù)據(jù)來(lái)看，80℃滅活方案的有效性得到了支持。但是在60℃、70℃滅活方案中，在加熱溫度、時(shí)間相同的條件下，隨著滅活對(duì)象菌懸液濃度的增大，細(xì)菌的殘存數(shù)呈增多趨勢(shì)。因此，必須考慮到菌液濃度因素的影響，如果菌液濃度繼續(xù)增大，甚至遠(yuǎn)超出本次實(shí)驗(yàn)100mg/ml的范圍，80℃的滅活方案是否也會(huì)出現(xiàn)殘存的活菌？這是個(gè)值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題，可能也是80℃滅活方案還具有爭(zhēng)議性的問(wèn)題所在。另一方面，從表1還可以看到：在菌液濃度、加熱時(shí)間相同的情況下，隨著加熱溫度的增大，細(xì)菌的殘存數(shù)呈減少趨勢(shì)；在菌液濃度、加熱溫度相同的條件下，隨著加熱時(shí)間的增加，細(xì)菌的殘存數(shù)呈減少趨勢(shì)。所以，筆者建議：在不影響后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的前提下，宜提高滅活溫度或者延長(zhǎng)滅活時(shí)間，以最大程度地降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

二、關(guān)于影響紫外線(xiàn)照射滅活結(jié)核分枝桿菌效果的因素分析

本次紫外線(xiàn)照射滅活實(shí)驗(yàn)只設(shè)計(jì)了時(shí)間梯度和菌液濃度梯度，解讀表2結(jié)果數(shù)據(jù)，滅活效果影響因素跟熱滅活實(shí)驗(yàn)有相似之處：延長(zhǎng)作用時(shí)間會(huì)增強(qiáng)滅活效果，菌液濃度的增大會(huì)減弱滅活效果。紫外線(xiàn)消毒有一個(gè)特別需要注意的特點(diǎn)是紫外線(xiàn)的穿透力弱，任何可以阻擋紫外線(xiàn)穿透的東西都會(huì)減弱滅活效果，如空氣濕度、菌液厚度，等等。因此，生物安全柜每次紫外線(xiàn)消毒前應(yīng)先用能有效殺滅結(jié)核分枝桿菌的75%乙醇擦拭污染的工作臺(tái)面，雙管齊下，以最大程度地滅活污染臺(tái)面的活菌。另外，根據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道，用紫外線(xiàn)對(duì)物體表面進(jìn)行消毒時(shí)，燈管距物體表面的距離一般不超過(guò)1 m，照射時(shí)間一般不少于30 min［5］。本次實(shí)驗(yàn)在照射距離為0.7 m的條件下，照射時(shí)間達(dá)到40 min才能檢測(cè)不出殘存的活菌，與文獻(xiàn)報(bào)道相似。

其實(shí)，紫外線(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺菌效能，周維新［6］早有研究。結(jié)核分枝桿菌對(duì)紫外線(xiàn)敏感，室內(nèi)空氣和物體表面可直接照射部分，紫外線(xiàn)消毒效果肯定有效［3］。使用紫外線(xiàn)滅菌裝置進(jìn)行物品表面消毒時(shí)，燈管距離物體表面不得超過(guò)1 m，應(yīng)使照射表面受到紫外線(xiàn)的直接照射，且應(yīng)達(dá)到足夠的照射劑量，使用中燈管的照射強(qiáng)度不得低于70μW/cm2；使用紫外線(xiàn)滅菌裝置進(jìn)行室內(nèi)空氣消毒時(shí)，房間內(nèi)應(yīng)保持清潔干燥，溫度低于20℃或高于40℃，相對(duì)濕度大于60%時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)照射時(shí)間［7］。消毒效果與距離成反向線(xiàn)性關(guān)系［8］。

因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌是高致病性、可以經(jīng)呼吸道傳染的病原微生物，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。本次紫外滅活實(shí)驗(yàn)只能模擬物體表面受菌液污染，局限于用生物安全柜內(nèi)置的紫外線(xiàn)燈進(jìn)行。燈管離工作臺(tái)面垂直照射距離約70 cm，故不能設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的照射距離，亦不能設(shè)計(jì)氣溶膠滅活實(shí)驗(yàn)，這是本次實(shí)驗(yàn)的局限。

［1］劉國(guó)傳，劉來(lái)福，張利峰，等.檢驗(yàn)檢疫病原微生物實(shí)驗(yàn)室的生物安全.檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2009，19（3）：50-52.

［2］陸兵，劉秋煥，王榮，等.結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室獲得性感染事件分析.中國(guó)防癆雜志，2012，34（5）：333-335.

［3］陳明亭，萬(wàn)康林.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊(cè).北京：科學(xué)出版社，2011.

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［7］王黎霞，成詩(shī)明，何廣學(xué)，等.中國(guó)結(jié)核感染控制標(biāo)準(zhǔn)操作程序.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012.

［8］周維新.紫外線(xiàn)輻射強(qiáng)度與電壓和距離的關(guān)系.中國(guó)消毒學(xué)雜志，1991，10（4）：237-238.

（本文編輯：薛愛(ài)華）

國(guó)家“十二五”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX10004903；2013ZX10003001）

510630廣州，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室（賴(lài)賽麟、孫毅凡、江振友）；廣東省結(jié)核病控制中心 廣東省“十二五”結(jié)核病防治轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（李海成、郭卉欣、陳濤、江勇、錢(qián)明、周琳、鐘球）；廣東省佛山市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（王威）

鐘球，Email：zhongqiu@vip.163.com

2013-06-06）