陳丹丹 朱圭娜 關光玉 Magda Ellis Donald P.Mc Manus 楊玉榮

·論 著 ·

VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點多態(tài)性與寧夏人群結核易感性研究

陳丹丹 朱圭娜 關光玉 Magda Ellis Donald P.Mc Manus 楊玉榮

目的 探討維生素D受體（VDR）基因TaqⅠ、FokⅠ位點基因多態(tài)性與寧夏回族自治區(qū)人群肺結核易患性之間的關系。方法 搜集寧夏南部8個地區(qū)2010年7—11月確診的肺結核患者993例（簡稱“病例組”），其中男550例，女443例；同期選擇來源地區(qū)，與病例組性別相同、民族相同、年齡相當、居住環(huán)境相匹配的確認無肺結核的健康人880名（簡稱“對照組”），其中男485名，女395名。將聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCRRFLP）檢測VDR基因多態(tài)性的方法，應用于人群結核病易感性的病例-對照研究。用SPSS 16.0軟件對檢測結果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，各基因型與結核易感性關系用單因素分析和多因素logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果VDR-TT、Tt、tt基因型在病例組和對照組中分布頻率分別為83.0%（815/982）、15.2%（149/982）、1.8%（18/982）和84.7%（739/872）、14.7%（128/872）、0.6%（5/872），病例組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 6.15，P=0.046）。VDR-FF、Ff、ff基因型病例組和對照組分布頻率分別為32.4%（316/976）、47.9%（468/976）、19.7%（192/976）和28.5%（245/861）、53.3%（459/861）、18.2%（157/861），病例組和對照組分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=5.41，P=0.067）。在顯性基因模型中，VDR-（TT十Tt）、tt基因型病例組和對照組中分布頻率分別為98.2%（964/982）、1.8%（18/982）和99.4%（867/872）、0.6%（5/872），病例組和對照組中分布差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.98，P=0.014；OR=0.98、3.19，95%CI=0.978～0.997、1.193～8.574）；在純合基因模型中VDR-（FF十ff）、Ff基因型在病例組和對照組中頻率分別為52.0%（508/976）、48.0%（468/976）和46.7%（402/861）、53.3% （459/861），病例組和對照組分布差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.27，P=0.022；OR=1.12、0.89，95%CI=1.023～1.298、0.822～0.985）。結論 在寧夏人群中，肺結核易患性可能與VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點多態(tài)性有關聯(lián)，VDR-（FF十ff）、tt基因型可能是罹患肺結核的危險因素，而VDR-（TT十Tt）、Ff基因型可能是保護因素。

結核，肺/遺傳學； 受體，骨化三醇； 多態(tài)性，單核苷酸； 疾病遺傳易感性； 病例對照研究；寧夏［回族自治區(qū)］

維生素D（Vit D）的經典生物學功能是調節(jié)機體鈣磷代謝。但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Vit D在體液免疫和細胞免疫方面具有重要的調節(jié)功能［1-2］，與機體抗結核分枝桿菌的免疫保護機制有關。Vit D的活性代謝產物是1，25-二羥維生素D3，該產物生物學功能的發(fā)揮由Vit D受體（VDR）蛋白介導。人類VDR基因位于第12染色體長臂，其中，rs731236、rs2228570位點分別對應限制性內切酶TaqⅠ、FokⅠ的酶切位點［3］，兩位點位于基因外顯子處，單核苷酸的變化導致表達的維生素D受體蛋白異常，進而影響Vit D功能的正常發(fā)揮［4-5］，從而對結核的易感性產生一定影響。目前，有關VDR基因多態(tài)性與該地區(qū)肺結核易感性的相關報道較少，值得進一步研究。

聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）可用于檢測單核苷酸位點堿基的變化，且該方法簡便，分型時間短，實驗可在常規(guī)實驗室完成。病例-對照研究方法可通過某研究因素在病例組和對照組之間的分布差異，探究研究因素與疾病發(fā)生之間的關聯(lián)性，也是用于探索疾病的危險因素和病因的常用分析流行病學方法。為此，本研究以病例-對照研究方法為基礎，采用PCR-RFLP探討VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點基因多態(tài)性與寧夏人群肺結核發(fā)病的關系。為今后確定高危人群、肺結核的預防和治療等奠定基礎，提供可靠依據(jù)。

材料和方法

一、研究對象和實驗材料

1.研究對象：病例組來源于寧夏西吉、海原、涇源、彭陽、原州、同心、中衛(wèi)、隆德8個地區(qū)，并且在該地區(qū)居住10年以上的患者。2010年7—11月，按照結核病診斷標準［6］，經8地區(qū)的疾病預防控制中心相關專家確診的肺結核患者。納入標準：年滿18周歲，痰涂片或分離培養(yǎng)陽性，胸透X線片顯示結核征象，有臨床表現(xiàn)，咳嗽或咯痰2周以上或咯血；排除標準：伴有糖尿病、高血壓、哮喘、慢性阻塞性肺結核病、肺癌等并發(fā)癥，排除HIV、肝炎病毒感染，腫瘤患者及長期使用激素和器官移植等使免疫功能低下者。

對照組為同期選擇的，來源于該8個地區(qū)的健康人群，與納入患者性別相同，民族相同，年齡相當?shù)耐l(xiāng)。納入標準：年滿18周歲，無結核病，排除標準同病例組。

根據(jù)前期回顧性調查，寧夏南部地區(qū)登記的肺結核病的年患病率，估計每年為500/10萬～700/10萬。以α=0.05，β=0.5～0.8，樣本量至少應該≥1800才具有檢驗效能為50%～80%。具體由：http：// pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/gpc/cc2.html，計算所得。

共收集標本1873份。其中，病例組993例，其中男550例，女443例；漢族413例，回族580例；18～75周歲，平均年齡（48.4±18.2）歲。對照組經排查后，符合要求的為880名，其中男485名，女395名；漢族359名，回族521名；18～75周歲，平均年齡（46.8±16.6）歲。最后分析時，剔除無實驗結果的樣本后，TaqⅠ位點病例組982例，對照組872例，F(xiàn)okⅠ位點病例組976例，對照組861例。因調查地區(qū)漢族與回族通婚頻繁，民族血統(tǒng)不純正，最后分析時，未考慮民族對實驗結果的影響。

病例組和對照組性別構成差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.14，P=0.91），年齡構成差異無統(tǒng)計學意義（t=1.91，P=0.06）。

2.儀器設備：制冰機：寧波格蘭特制冷設備制造有限公司XB70；低溫高速離心機：美國貝克曼庫爾特商貿有限公司TJ-6；核酸蛋白分析儀：Thermo NANODROP 2000；PCR儀：BIO-Cyclery；凝膠成像儀：BIO-RAD Image Lab 3.0。電泳儀：北京市六一儀器廠DYY-6C；電泳槽：北京市六一儀器廠DYCP-31DN。

3.試劑耗材：10%十二烷基磺酸鈉（SDS）：Sigma公司生產；Proteinase K（Sigma ALDRICH Lot# 080M8609V）：Sigma公司生產；RNase A（Cat No.12091-039 Lot：1253939）：Invitrogen公司生產；PCR試劑（Promega Go Taq Colorless Master Mix）：Promega公司生產；FokⅠ（D1046B）：TaKa-Ra（大連）寶生物工程；TaqⅠ：Promega公司生產。

二、方法

（一）調查方法

所有參加者為自愿參加，并簽署《知情同意書》。對所有參加者提供免費的一般性的臨床檢查和一次乙型肝炎（簡稱“乙肝”）全套檢查和肝功能檢查。隨后進行一對一的問卷調查填寫《肺結核易感性調查登記表》，調查表主要由澳大利亞結核研究所課題組Ellis博士和昆士蘭醫(yī)學研究所的Mc Manus教授和楊玉榮教授商定，調查人員為各縣市CDC結核病防治所相關負責人員，工作開展前對調查人員在寧夏醫(yī)科大學集中2 d培訓，收集標本的過程中集中討論遇到的問題及解決辦法。調查內容除基本信息（姓名、性別、年齡、民族、家庭住址、聯(lián)系方式等）外，還包括結核既往史、卡介苗接種史、乙肝史、其他疾病史。同時用一次性抗凝采血管抽取靜脈血5 ml，-80℃凍存?zhèn)溆?。在標本收集初期課題組人員現(xiàn)場跟蹤收集標本的全過程，所收集標本暫時存放于各縣市CDC實驗室的-20℃或-80℃冰箱中，每個月集中送往寧夏醫(yī)科大學實驗室檢測。

（二）檢測方法

1.基因組DNA提?。翰捎昧呀饧t細胞法［7］，低滲溶解紅細胞，離心收集白細胞，以10%SDS裂解白細胞，以Proteinase K消化蛋白，以RNase A降解RNA，以異丙醇和乙醇抽提和洗滌DNA，最后以1×Tris-EDTA buffer（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，p H=8.0）溶解基因組DNA。用核酸定量儀測量DNA的純度和濃度。1.8＜A260/A280＜2.0，則DNA純度符合要求。

2.PCR擴增：采用在線引物設計軟件Primer 3設計引物（TaqⅠ：上游5′-CTAAATGCACGGAGAAGTCACTG-3′，下游5′-TTCTGGATCATCTTGGCATAGAG-3′；FokⅠ：上游5′-AGCTATGTAGGGCGAATCATGT-3′，下游5′-TCCAAGAGAGTCAGAGGAACATC-3′），由Invitrogen公司合成。采用96孔板進行PCR反應，TaqⅠ位點PCR反應體系25μl：Master Mix 12.5μl，上/下游引物各0.5μl（5 pmol），模板2μl（100 ng），無核酸酶水9.5μl。循環(huán)條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72℃總延伸5 min。FokⅠ位點PCR反應體系25μl：Master Mix 12.5μl，上/下游引物各0.5μl（5 pmol），模板1μl（50 ng），無核酸酶水10.5μl。循環(huán)條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃總延伸5 min。擴增產物采用2%的瓊脂糖凝膠［溴化乙錠（EB）濃度0.5μg/ml］，電壓120 V，1 h電泳檢測，可用。

3.酶切分型：以DNA含量較多的樣本進行酶切作用預實驗，確定酶切反應時酶的濃度、酶切作用的溫度和時間、電泳分型凝膠的大小，電泳電壓和時間，選取用于檢測酶切作用效果的控制標本1（C1）和控制標本2（C2）。C1為ttff基因型，酶切后TaqⅠ位點2個片段（219 bp、102 bp）、FokⅠ位點3個片段（345 bp、156 bp、63 bp）；C2為TtFt基因型，酶切后TaqⅠ位點3個片段（321 bp、219 bp、102 bp）、FokⅠ位點4個片段（408 bp、345 bp、156 bp、63 bp）。以最佳反應條件用于實驗。

采用96孔板進行酶切。每板添加C1、C2、無菌水各一個。酶切作用后C1、C2、無菌水均符合理論結果，該板結果可用，否則重新試驗。TaqⅠ位點酶切體系：PCR產物7μl，TaqⅠ酶0.5μl（5 U），BSA 2μl，Buffer E 2μl，補無菌水到20μl，37℃酶切3 h。FokⅠ位點酶切體系：PCR產物9μl，F(xiàn)okⅠ酶（TaKaRa公司）0.5μl（5 U），10×M 2μl，BSA 2μl，補無菌水到20μl，37℃酶切2 h。酶切產物取10μl，以50 bp或100 bp DNA Marker為對照，采用3%的瓊脂糖凝膠，120 V，1 h，電泳檢測。

酶切分型：VDR-TaqⅠ位點若為等位基因T，則PCR產物中不存在TaqⅠ酶切位點，酶切產物為321 bp 1個片段，若為等位基因t，則存在一個酶切位點，酶切產物為219 bp、102 bp 2個片段，因此，酶切后可產生三種基因型TT（321 bp），Tt（321 bp、219 bp、102 bp）和tt（219 bp、102 bp）（圖1）。VDRFokⅠ位點若為等位基因F，則PCR產物中有一個酶切位點，酶切產物為408 bp、156 bp 2個片段，若為等位基因f，PCR產物有兩個酶切位點，酶切產物為345 bp、156 bp和63 bp 3個片段，酶切后可產生FF（408 bp、156 bp），F(xiàn)f（408 bp、345 bp、156 bp、63 bp）和ff（345 bp、156 bp、63 bp）3種基因型（圖2）。

1、2、3、M分別表示tt、TT、Tt基因型和100 bp Marker 圖1 VDR-TaqⅠ酶切電泳圖片

1、2、3、M分別表示ff、Ff、FF基因型和50 bp Marker 圖2 VDR-FokⅠ酶切電泳圖片

（三）數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用雙人平行錄入法，由兩人同時將數(shù)據(jù)以Excel表格形式錄入計算機，并進行一致性核對，確保數(shù)據(jù)輸入無誤。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。病例組與對照組一般情況進行均衡性比較；進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測；各基因型與肺結核的相關性采用χ2檢驗，為排除混雜因素的影響，進一步分析采用多因素logistic回歸分析。OR值表示病例組與對照組的優(yōu)勢比，OR=1，說明變量對疾病不起作用，OR＞1，說明變量是危險因子，反之是保護因子。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

（四）所用公式

基因型頻率（觀測值）：通過測定群體中某種基因型在該群體中所占的率。

等位基因頻率（觀測值）：通過測定群體中某種等位基因在該群體中所占的率。

基因型頻率（期望值）：根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律計算的某種基因型在該群體中所占的率。

即（PT十Pt）2=PT2十2·PT·Pt十Pt2=1，TT基因型頻率PTT=PT2；

TT基因型頻數(shù)：=N·PTT；

Tt基因型頻率PTt=2·PT·Pt；

Tt基因型頻數(shù)=N·PTt；

tt基因型頻率Ptt=Pt2；

tt基因型頻數(shù)=N·Ptt；

N為該二倍體個體總數(shù)。

結 果

1.Hardy-Weinberg平衡分析：經遺傳平衡檢測，VDR-TaqⅠ兩多態(tài)性位點基因型頻數(shù)在病例組和對照組人群之間的分布與Hardy-Weinberg定律的理論分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.046，P= 0.83），說明所選取的樣本來自遺傳平衡狀態(tài)的人群。VDR-FokⅠ位點經檢測（χ2=5.166，P= 0.02），可能是由于樣本數(shù)量太小造成（表1）。

表1 對照組VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢測

2.基因型、等位基因在病例組和對照組分布：結果顯示，除VDR-TaqⅠ位點基因型分布在病例組和對照組中差異有統(tǒng)計學意義外（P＜0.05），其余基因型和等位基因在病例組和對照組中的分布頻率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2、3）。

3.基因型模型在病例組和對照組中的分布：根據(jù)肺結核的發(fā)生與等位基因顯隱性及基因型純合度的關系，可將理論上控制表型的VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點的基因型分為以下幾類：TaqⅠ位點的堿基T為顯性基因、FokⅠ位點的堿基C為顯性基因，則TaqⅠ、FokⅠ位點基因型可依次分為TT十Tt、tt，F(xiàn)F十Ff、ff兩類；若TaqⅠ位點的堿基T為隱性基因、FokⅠ位點的堿基C為隱性基因，則兩位點基因型可依次分為TT、Tt十tt，F(xiàn)F、Ff十ff；若表現(xiàn)與基因純合度有關，則兩位點基因型一次分為TT十tt、Tt，F(xiàn)F十ff、Ff兩種基本類型（表4）。

TaqⅠ位點顯性基因模型中，TT十Tt、tt基因型病例組和對照組分布頻率分別為98.2%（964/982）、1.8%（18/982）和99.4%（867/872）、0.6%（5/872），TT十Tt基因型對比tt基因型是結核的保護因子，OR（95%CI）：0.98（0.978～0.997）；FokⅠ位點純合基因模型中FF十ff、Ff基因型在病例組和對照組分布頻率分別為52.0%（508/976）、48.0%（468/976）和46.7%（402/861）、53.3%（459/861），F(xiàn)F十ff基因型對比Ff基因型人群罹患肺結核的風險增加，OR（95%CI）：1.12（1.023～1.298）。其他基因型模型在病例組和對照組中分布差異無統(tǒng)計學意義（表4）。

表2 兩組中VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點基因型、等位基因的分布

表3 兩組中VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點等位基因的分布

表4 基因型模型在病例組和對照組中的分布

續(xù)表4

4.多因素logistic分析：為排除性別、年齡、民族對結果的影響，以是否發(fā)病為因變量，以各種基因模型為自變量，進行多因素非條件logistic回歸分析（表5），結果顯示VDR-（TT十Tt）基因型可能是結核的保護因子（OR=0.307，95%CI=0.113～0.833），VDR-（FF十ff）基因型可能是罹患肺結核的危險因子（OR=1.242，95%CI=1.031～1.495）（表6）。

表5 不同變量的多因素非條件logistic回歸分析賦值表

表6 多因素logistic分析結果

討 論

世界衛(wèi)生組織調查顯示，中國是結核第二高發(fā)區(qū)，僅次于印度。為控制肺結核的疫情，我國已做過5次全國范圍內的肺結核流行病學抽樣調查。據(jù)2010年調查顯示，肺結核防治工作取得顯著成效，全國肺結核患病率呈下降趨勢，但是疫情仍然非常嚴重［8］。全球約有1/3人口感染結核分枝桿菌，其中約10%的人最終發(fā)展為結核病患者［9］，提示感染結核分枝桿菌后，結核病的發(fā)生除自身免疫狀態(tài)、環(huán)境因素外，可能還與機體的遺傳狀態(tài)有關。目前已發(fā)現(xiàn)的結核易感基因有HLA和非HLA基因兩大類，在非HLA基因中，VDR基因作為侯選基因受到頗多的關注。

關于VDR基因多態(tài)性與結核易感性的關聯(lián)性，已有大量國內外學者進行過相關研究，但是研究結論有較大差異。Wilkinson等［10］對古吉拉特族人的研究顯示VDR-TT/Tt基因型和VDR-ff基因型合并Vit D缺失是罹患結核病的危險因素。Merza等［11］對伊朗患者、Lombard等［12］對南非人群的研究顯示，VDR基因多態(tài)性與結核患病無關。Lewis等［13］進行的Meta分析也顯示該基因多態(tài)性與結核患病無關。王喜等［14］研究顯示VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點多態(tài)性與新疆維吾爾族人群結核易患性無關。李春 柱等［15］針 對 新 疆 哈 薩 克 族 人 群 研究 顯 示VDR-ff基因型是罹患結核病的危險因素，趙真真、Gao等［16-17］的研究也顯示VDR-ff基因型是罹患結核病的危險因素。高玉婧等［18］對寧夏人群的研究顯示FokⅠ位點多態(tài)性與結核患病無關。但是，此次針對寧夏人群的研究顯示，VDR-TaqⅠ、FokⅠ位點多態(tài)性與結核易感性有關，在顯性基因模型中，（TT十Tt）基因型可能是結核的保護因子，tt基因型可能是罹患結核病的危險因素，在純合基因模型中VDR-（FF十ff）基因型可能是結核的危險因素，在排除混雜因素后差異仍有統(tǒng)計學意義，與以往研究有差別。

研究結論不同的原因可能是肺結核的發(fā)生是由多基因控制的，單個位點對其作用不明顯；不同的地區(qū)和民族之間存在差異；受研究條件所限，選取的樣本較少或較片面，可能造成一定程度的結果差異。關于VDR基因多態(tài)性與肺結核發(fā)病之間的真正關系，該基因與環(huán)境因素、其他易感基因之間的交互作用尚需進一步加強研究。

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Genetic polymorphisms in VDR-Taq I and VDR-Fok I and susceptibility to tuberculosis among different populations in Ningxia,Peoples'Republic of China

CHEN Dan-dan*，ZHU Gui-na，GUAN Guang-yu，Magda Ellis，Donald P.McManus，YANG Yu-rong.*Human Pathogen and Immunology Department，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China

YANG Yu-rong，Email：yangyurong@hotmail.com

Objective This study aimed to explore the relationship between SNP polymorphisms in TaqⅠand FokⅠin the Vitamin D Receptor（VDR）gene and susceptibility to pulmonary tuberculosis（PTB）among the populations in Ningxia Hui Autonomous Region（NHAR），P.R.of China.Methods The confirmed 993 PTB cases（550 males and 443 females）were recruited in different TB clinics of southern NHARin 2010，who had been diagnosed according to WHO TB-diagnosis criteria，without any other co-infections.The 880 healthy matched controls，including 485 males and 395 females were recruited to match the sex，nationality，age and residential area of the TB cases.The detection of two SNPs（TaqⅠ，F(xiàn)okⅠ）in the VDR gene was demonstrated by use of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）analysis.All data were entered into the SPSS 16.0 software package.The population data were tested by the Hardy-Weinberg method and then multiple logistic regression models were used for further investigation of the risk gene SNPs in different genetic models，and included covariates that had shown association with disease in the univariate analysis.The significance value was de-termined within 95%confidential intervals with P＜0.05.Results The genotype frequencies of VDR-TT，Tt and tt were 83.0%（815/982），15.2%（149/982），1.8%（18/982）and 84.7%（739/872），14.7%（128/872），0.6% （5/872）in the case and control groups，respectively，with significant difference（χ2=6.15，P=0.046）.The genotype frequencies of VDR-FF，F(xiàn)f and ff were 32.4%（316/976），47.9%（468/976），19.7%（192/976）and 28.5% （245/861），53.3%（459/861），18.2%（157/861）in the case and control groups，respectively，without any significant differences between the case and control groups.The genotype frequencies in the dominant model of VDR-（TT十Tt），tt were 98.2%（964/982），1.8%（18/982）and 99.4%（867/872），0.6（5/872）in the case and control groups with significantly different value（χ2=5.98，P=0.014）and an OR（95%CI s）of 0.98，3.19（0.978-0.997，1.193-8.574）.The genotype frequencies in the heterozygote model of VDR-（FF十ff），F(xiàn)f were 52.0% （508/976），48.0%（468/976）and 46.7%（402/861），53.3%（459/861）in cases and controls，with significant value（χ2=5.27，P=0.022）and an OR（95%CI s）of 1.12，3.19（1.023-1.298，0.822-0.985）.Conclusion The VDR TaqⅠand FokⅠpolymorphism was associated with susceptibility to human pulmonary tuberculosis amongst Ningxia Populations.The genotype of the VDR-（FF十ff），tt showed a potential association with risk factors to human pulmonary tuberculosis in the study population groups.The genotypes of the VDR-（TT十Tt）and Ff may be associated with increased resistance to disease.

Tuberculosis，pulmonary/genetics； Receptors，calcitriol； Polymorphism，single nucleotide；Genetic predisposition to disease； Case-control studies； Ningxia

2013-04-24）

（本文編輯：張曉進）

NHMRC（National Health Medical Research Councils，APP1025166）

750004銀川，寧夏醫(yī)科大學病原生物學與免疫學系［陳丹丹（研究生）、朱圭娜（研究生）、楊玉榮］；寧夏疾病預防控制中心研究所（關光玉）；澳大利亞新南威爾士州結核研究所（Magda Ellis）；澳大利亞昆士蘭醫(yī)學研究所傳染病研究部（Donald P.McManus）

楊玉榮，Email：yangyurong@hotmail.com