江勇 錢明 王威 陳濤 李海成 陳燕梅 卓文基 郭卉欣 周琳 鐘球

·論 著 ·

卷曲霉素在羅氏培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性研究

江勇 錢明 王威 陳濤 李海成 陳燕梅 卓文基 郭卉欣 周琳 鐘球

目的 檢測(cè)卷曲霉素（Cm）在羅氏培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性，了解Cm在羅氏培養(yǎng)基中的降解速率；檢測(cè)Cm降解對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的影響。方法 用高效液相色譜儀分別檢測(cè)4℃和37℃2種保存條件下，Cm在羅氏培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性；使用不同保存條件下的羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，以驗(yàn)證Cm降解對(duì)敏感性試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果 在4℃保存時(shí)，羅氏培養(yǎng)基中的Cm含量與時(shí)間呈反比，保存10 d時(shí)，羅氏培養(yǎng)基中的Cm降解2.04%，保存40 d時(shí)，Cm降解21.5%，保存80 d時(shí)，Cm降解41.7%，保存到200 d時(shí)，檢測(cè)不到Cm的存在；在37℃保存10 d時(shí)，羅氏培養(yǎng)基中的Cm降解46.8%；在37℃保存30 d時(shí)，無法在羅氏培養(yǎng)基中檢測(cè)到Cm的存在。在4℃存儲(chǔ)時(shí)間為10～160 d的Cm羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)（DST）時(shí)，MIC在0.8～1.0μg/ml菌株，在4℃存儲(chǔ)時(shí)間為40 d的Cm羅氏培養(yǎng)基上生長6周后出現(xiàn)16個(gè)菌落。MIC在1.0～1.5μg/ml菌株，在4℃存儲(chǔ)時(shí)間為40 d的Cm羅氏培養(yǎng)基上生長6周后出現(xiàn)陽性結(jié)果（十）。結(jié)論 Cm羅氏培養(yǎng)基在37℃保存時(shí)不穩(wěn)定，在4℃保存時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，但存儲(chǔ)時(shí)間不應(yīng)超過40 d。

分枝桿菌，結(jié)核； 培養(yǎng)基； 微生物敏感性試驗(yàn)； 卷曲霉素硫酸鹽； 色譜法，高壓液相

結(jié)核?。╰uberculosis）是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）通過空氣傳播感染的慢性傳染病，是主要的國際公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)估計(jì)，全球每年大約有接近800萬例感染結(jié)核?。?-2］。近年來結(jié)核病的總體發(fā)病率在下降，但是結(jié)核病耐藥現(xiàn)象卻逐漸變得嚴(yán)重［3-4］。不恰當(dāng)?shù)墓芾泶胧┖椭委煼桨甘菍?dǎo)致耐藥菌增加，以及耐藥程度加重的主要原因［5］。目前，耐藥結(jié)核病的診斷主要依賴于實(shí)驗(yàn)室的藥物敏感性試驗(yàn)（DST）結(jié)果，DST是一個(gè)步驟很多的復(fù)雜性試驗(yàn)，對(duì)DST的結(jié)果造成影響的因素較多，本研究關(guān)注了含藥培養(yǎng)基中藥物穩(wěn)定性對(duì)DST結(jié)果的影響，目的是了解含藥培養(yǎng)基中藥物不穩(wěn)定性是否是DST不準(zhǔn)確的一個(gè)原因，通過本研究對(duì)含藥培養(yǎng)基有效期的確定提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。

材料和方法

1.菌株及試劑：結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC93009）來自中國藥品生物制品檢定所；9株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株由佛山市第四人民醫(yī)院提供；卷曲霉素（Cm）購自于Sigma公司（美國）；硫酸卷曲霉素（用于HPLC方法學(xué)驗(yàn)證）購自于海正藥業(yè)股份有限公司；甲醇、異丙醇為色譜純，購自于Sigma公司（美國）。

2.主要設(shè)備：高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC），L-6200三元泵，L-4200紫外檢測(cè)器，655A-40自動(dòng)進(jìn)樣器，655A-52柱溫箱，D-2000色譜整合器購自于Hitachi公司（日本）。組織勻漿機(jī)購自于QIAGEN公司（美國）。

3.實(shí)驗(yàn)方法：用HPLC監(jiān)測(cè)羅氏培養(yǎng)基Cm的濃度。硫酸卷曲霉素配制成最終濃度為90 mg/ml的內(nèi)標(biāo)液；取Cm羅氏培養(yǎng)基約0.5 ml加入1 ml的99.99%純度的甲醇放在組織勻漿機(jī)中混勻；5000×g離心10 min，取上清液進(jìn)行高效液相色譜分析。使用4℃存儲(chǔ)時(shí)間為10、20、30、40、60、80、120、160 d 的Cm羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)。選擇3株已知最低抑菌濃度（MIC）的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)：1株MIC＜0.05μg/ml；1株MIC在0.8～1.0μg/ml；1株MIC在1.0～1.5μg/ml。比例法DST根據(jù)WHO指南，在含40μg/ml Cm的羅氏培養(yǎng)基上接種菌濃度為10-2g/L和10-4g/L時(shí)的菌落形成單位（CFU）臨床分離株，質(zhì)控菌株H37Rv（MIC在0.1～0.2μg/ml）作為對(duì)照菌株。

HPLC方法有效性評(píng)價(jià)：HPLC測(cè)定Cm濃度方法的準(zhǔn)確性和精確性見表1，對(duì)Cm低、中、高3個(gè)濃度監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)Cm日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）分別＜1.98%和＜2.78%。對(duì)于所有測(cè)試樣本Cm回收率在98.99%～103.91%。Cm在不同介質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線在5～50μg/ml的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系，r均＞0.998（表1）。HPLC檢測(cè)Cm濃度時(shí)，Cm在羅氏培養(yǎng)基的最低檢測(cè)限（LOD）為0.09μg/ml，最小定量限（LOQ）為0.25μg/ml。

結(jié) 果

1.Cm在羅氏培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性：在37℃保存時(shí)，Cm在羅氏培養(yǎng)基中10 d后就降解了46.8%，于30 d后無法檢測(cè)到羅氏培養(yǎng)基中的Cm存在。

表1 3種Cm濃度HPLC檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精確性

含Cm的羅氏培養(yǎng)基在4℃保存時(shí)，保存10 d時(shí)，羅氏培養(yǎng)基中的Cm降解2.04%，保存40 d時(shí)，Cm降解21.5%，保存80 d時(shí)，Cm降解41.7%，保存到200 d時(shí)，檢測(cè)不到Cm的存在（圖1）。

圖1 含Cm的羅氏培養(yǎng)基在37℃、4℃保存條件下Cm的降解情況

2.比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果：對(duì)部分MIC值接近或小于耐藥臨界值的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株和對(duì)照菌株H37Rv進(jìn)行比例法DST檢測(cè)。在新鮮制備的和在4℃存儲(chǔ)時(shí)間分別為10～160 d的含Cm羅氏培養(yǎng)基中，對(duì)同一菌株進(jìn)行比例法DST檢測(cè)。當(dāng)Cm對(duì)臨床菌株的MIC＜0.05μg/ml時(shí)，不同存儲(chǔ)時(shí)間的羅氏培養(yǎng)基上進(jìn)行的DST檢測(cè)結(jié)果差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)臨床菌株的 MIC在臨界值附近時(shí)，不同存儲(chǔ)時(shí)間的DST檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在存儲(chǔ)時(shí)間超過40 d的羅氏培養(yǎng)基中，原本敏感的菌株可能會(huì)出現(xiàn)一個(gè)耐藥的結(jié)果，并且含Cm羅氏培養(yǎng)基存儲(chǔ)時(shí)間越長，菌落出現(xiàn)的越早；在4℃存儲(chǔ)時(shí)間為160 d的含Cm羅氏培養(yǎng)基中，菌落出現(xiàn)要早于其他存儲(chǔ)時(shí)間的含Cm羅氏培養(yǎng)基。部分結(jié)核分枝桿菌臨床分離株和對(duì)照菌株H37Rv的比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

討 論

隨著耐藥結(jié)核病在世界范圍內(nèi)的流行越來越廣泛，以羅氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的DST檢測(cè)技術(shù)在臨床上的應(yīng)用也越來越多。羅氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的DST檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)和低收入國家廣泛應(yīng)用。但是羅氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的DST檢測(cè)技術(shù)存在一些缺

點(diǎn)，眾所周知的就是使用固體培養(yǎng)基進(jìn)行DST非常耗時(shí)，需要6周（比例法）時(shí)間報(bào)告結(jié)果，且結(jié)果有時(shí)不一致且重復(fù)性較低。另一個(gè)缺點(diǎn)是，該技術(shù)還沒有完全標(biāo)準(zhǔn)化。雖然世界衛(wèi)生組織制定了以羅氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的DST檢測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，但有些指標(biāo)很難標(biāo)準(zhǔn)化，例如，羅氏培養(yǎng)基的質(zhì)量等。諸多不確定因素使得建立關(guān)于固體培養(yǎng)基DST的外部質(zhì)量保證體系存在困難，由此也影響了實(shí)驗(yàn)室間同類檢測(cè)數(shù)據(jù)的可比性。

表2 不同樣本、MIC濃度與存儲(chǔ)時(shí)間的結(jié)核分枝桿菌的比例法DST檢測(cè)結(jié)果

關(guān)于HPLC測(cè)定RFP濃度的方法已被報(bào)道［6-8］，但并沒有關(guān)于檢測(cè)羅氏培養(yǎng)基Cm濃度的方法報(bào)道。本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)的以高效液相色譜法測(cè)定羅氏培養(yǎng)基中Cm濃度的方法，可以作為一種對(duì)含Cm培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量控制的方法。

含Cm培養(yǎng)基在4℃保存時(shí)相對(duì)于在37℃時(shí)保存要穩(wěn)定，但是隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長，Cm的降解也很明顯（圖1）。從理論上講，隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長，培養(yǎng)基中的Cm濃度降低，則使用不同存儲(chǔ)時(shí)間的培養(yǎng)基進(jìn)行DST必然會(huì)產(chǎn)生一些不一致的檢測(cè)結(jié)果，勢(shì)必有部分敏感株在存儲(chǔ)時(shí)間較長的培養(yǎng)基中DST檢測(cè)結(jié)果為耐藥。根據(jù)對(duì)含Cm的羅氏培養(yǎng)基在存儲(chǔ)過程中藥物穩(wěn)定性的檢測(cè)數(shù)據(jù)，不推薦使用存儲(chǔ)超過40 d的含Cm羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行DST檢測(cè)；本研究中多項(xiàng)數(shù)據(jù)表明，培養(yǎng)基中藥物的降解可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室DST檢測(cè)結(jié)果“假陽性”的一個(gè)原因。

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The research on capreomycin stability in Roche medium

JIANG Yong*，QIAN Ming，WANG Wei，CHEN Tao，LI Hai-cheng，CHEN Yan-mei，ZHUO Wen-ji，GUO Hui-xin，ZHOU Lin，ZHONG Qiu.*Center for Tuberculosis Control and Prevention of Guangdong Province，Guangzhou 510630，China

ZHOU Lin，Email：gdtb-bg@vip.163.com；ZHONG Qiu，Email：zhongqiu@vip.163.com

Objective To detect the stability of capreomycin（Cm）in the Roche medium，and find out the degradation rate of Cm in Roche medium and to detect the influence of Cm degradation on drug sensitive test. Methods The high performance liquid chromatograph（HPLC）test was used to detect the stability of Cm under preservation condition of 4℃and 37℃in Roche medium；Cm under different preservation condition was used to conduct drug sensitive test（DST）to detect the influence of Cm degradation on drug sensitive test.Results Preserved in 4℃，the concentration of Cm in Roche medium is inversely proportional to time，the degradation of Cm in Roche medium is close to 2.04%after 10 days，the degradation is 21.5%after 40 days，the degradation is 41.7% after 80 days，and Cm was not detected after 200 days.Preserved in 37℃，the degradation of Cm in Roche medium is close to 46.8%after 10 days，and Cm was not detected after 30 days.In the Cm Roche medium preserved at 4℃for 10-160 days，DST results showed that in the strain which minimal inhibitory concentration（MIC）is between 0.1 to 0.2μg/ml，16 colonies were observed after 6 weeks in the Roche medium preserved in 4℃for 40 days.In the strain which MICis between 1.0 to 1.5μg/ml，positive result（十）was reported after 6 weeks in the Roche medium preserved in 4℃for 40 days.Conclusion Cm Roche medium is unstable when stored at 37℃，it should be preserved at 4℃and should be used within 40 days.

Mycobacterium tuberculosis； Culture media； Microbial sensitivity tests； Capreomycin sulfate；Chromatography，high pressure liquid

2013-06-06）

（本文編輯：薛愛華）

“十二五”國家科技重大專項(xiàng)（2013ZX10003001）

510630廣州，廣東省結(jié)核病控制中心（江勇、錢明、陳濤、李海成、陳燕梅、卓文基、郭卉欣、周琳、鐘球）；廣東省佛山市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（王威）

周琳，Email：gdtb-bg@vip.163.com；鐘球，Email：zhongqiu@vip.163.com