孫昌華 卜 文 李春令 任慶海 劉思當(dāng) （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271018）

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CP)又名環(huán)磷氮芥，安道生、癌得星或癌得散，是一種氮芥類化合物，是一種臨床上常用的免疫抑制和抗腫瘤藥物[2]，但其毒副作用較強(qiáng)，尤其是具有較強(qiáng)的致畸、致突變作用，影響人體生殖細(xì)胞及胎兒的生長(zhǎng)和發(fā)育，嚴(yán)重危害人類生殖健康。本文以環(huán)磷酰胺對(duì)SD大鼠Ⅲ段生殖毒性進(jìn)行研究，探討環(huán)磷酰胺對(duì)父母代(P代)母鼠妊娠期和哺乳期的體重、攝食量、藥后反應(yīng)及母鼠的妊娠率、死亡率、分娩情況和哺乳情況等指標(biāo)。Ⅲ段生殖毒性試驗(yàn)是為了檢測(cè)從著床到斷乳這段時(shí)間給藥對(duì)母體妊娠、哺乳以及胚胎和子代發(fā)育的不良影響。由于此階段所造成的影響可能延遲，試驗(yàn)應(yīng)持續(xù)觀察至子代性成熟階段。Ⅲ段生殖毒性具體表現(xiàn)為：妊娠動(dòng)物對(duì)毒性的敏感性增加；在子代出生前后導(dǎo)致其死亡；子代生長(zhǎng)發(fā)育的改變；子代的功能缺陷，包括行為、成熟和生殖[1]。F1代大鼠哺乳期內(nèi)每窩的數(shù)量、體重、外觀畸形、出生存活率、哺乳成活率、性別比例、身體發(fā)育指標(biāo)和神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)等。F1代雄鼠的生育率、雌鼠的妊娠率和孕鼠的攝食量、體重、窩重、卵巢重、黃體數(shù)、著床數(shù)、著床前丟失率、著床后丟失率及其仔鼠(F2代)的存活率、死胎率、吸收胎率等指標(biāo)。同時(shí)，研究環(huán)磷酰胺對(duì)SD大鼠生殖毒性的量效關(guān)系，為環(huán)磷酰胺在臨床上的合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇7～8周齡SPF級(jí)SD大鼠150只(♀100只，♂50只)；體重范圍：♀160g～190g，♂180g～210g；購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑環(huán)磷酰胺 購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)11081421。

1.1.3 主要儀器 穿梭實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，型號(hào)：ZHCSC，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；五鼠通用轉(zhuǎn)棒測(cè)試儀，型號(hào)：DigBehv-RRTR，上海吉量科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 妊娠動(dòng)物處理 將雄鼠與雌鼠l:l合籠。通過每日早上檢查陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓為受孕0天。P代每組準(zhǔn)備22只孕鼠，如果最后1天有多余孕鼠則繼續(xù)分配到各組中，F(xiàn)1代大鼠共交配2周。

1.2.2 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)原則分組，將孕鼠分為4組，分別為溶媒對(duì)照組(Veh)、環(huán)磷酰胺低劑量組(L)、中劑量組(M)、高劑量組(H)每組P代孕鼠不少于20只。

1.2.3 給藥方法 皮下注射給藥(sc)[1,4]。給藥劑量：低劑量組(L)10mg·kg-1，中劑量組(M)20mg·kg-1，高劑量組(H)40mg·kg-1[5,6]，溶媒對(duì)照組(Veh)給予氯化鈉注射液，給藥容積：5ml·kg-1。P代妊娠大鼠第15天和分娩后第1天、第6天、第12天、第18天各給藥1次，共5次。

1.2.4 動(dòng)物的處置 P代大鼠交配結(jié)束后，若孕鼠數(shù)量不夠，則繼續(xù)交配補(bǔ)足孕鼠數(shù)，若孕鼠分娩后達(dá)到所需數(shù)量，則剩余雌、雄大鼠CO2吸入法處死。P代雌鼠產(chǎn)仔后，檢查每窩出生時(shí)活仔數(shù)、死仔數(shù)、畸形數(shù)、出生存活率和哺乳成活率、體重、身體發(fā)育、性成熟和生育力、感覺功能、反射和行為等。P代雌鼠產(chǎn)仔后，每窩的仔鼠數(shù)進(jìn)行調(diào)整，每窩原則留4個(gè)雄性，4個(gè)雌性，盡量保持每個(gè)劑量組的雌雄仔鼠比例接近1:1，多余的仔鼠CO2處死。如果每窩中胎仔數(shù)少于8個(gè)，就不再調(diào)整。 P代哺乳雌鼠飼養(yǎng)其子代至21天離乳，每窩選擇雌、雄子代(F1代)大鼠各1只，每組留雌雄大鼠(F1代)各20只，不足時(shí)，用同一劑量組其它窩的仔鼠補(bǔ)齊，飼養(yǎng)至成年，然后進(jìn)行交配檢測(cè)其生殖能力，其余F1代大鼠離乳后CO2處死。F1代交配結(jié)束后，雄鼠和未交配上的雌鼠全部CO2處死。哺乳雌鼠哺乳結(jié)束后用CO2處死并做大體尸檢，F(xiàn)1代孕鼠妊娠15天時(shí)用CO2處死后做大體尸檢并觀察其胚胎發(fā)育情況等。

1.2.5 觀察指標(biāo) 按Ⅲ段生殖毒性常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，觀察各試驗(yàn)組環(huán)磷酰胺對(duì)父母代(P代)母鼠妊娠期和哺乳期的體重、攝食量、藥后反應(yīng)及母鼠的妊娠率、死亡率、分娩情況和哺乳情況等指標(biāo)。F1代大鼠哺乳期內(nèi)每窩的數(shù)量、體重、外觀畸形、出生存活率、哺乳成活率、性別比例、身體發(fā)育指標(biāo)和神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)等。F1代大鼠性成熟后，各劑量組雌雄大鼠1:1合籠交配，交配結(jié)束后，雄鼠安樂死，孕鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至妊娠15天剖檢，檢查F1代雄鼠的生育率、雌鼠的妊娠率和孕鼠的攝食量、體重、窩重、卵巢重、黃體數(shù)、著床數(shù)、著床前丟失率、著床后丟失率及其仔鼠(F2代)的存活率、死胎率、吸收胎率等指標(biāo)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察和剖檢觀察

2.1.1 P代母鼠孕期無流產(chǎn)、早產(chǎn)和異常死亡動(dòng)物 P代母鼠藥后觀察未出現(xiàn)明顯毒副反應(yīng)，哺乳期結(jié)束后剖檢的母鼠大體尸解未見明顯異常。L組P代孕鼠未見胎仔分娩，但剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)有著床痕；H組孕鼠分娩后全部剖檢，剖檢未見明顯異常。

2.1.2 F1代大鼠狀態(tài)觀察 F1代雌雄大鼠斷乳后，Veh組和L組的一般狀態(tài)觀察未見明顯異常。M組的一般狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)全部大鼠牙齒畸形。F1代雌全部交配成功。

2.2 動(dòng)物體重

2.2.1 P代孕鼠體重 由表1可知，P代孕鼠L和M組孕鼠的體重與Veh組比較，無明顯差異(P>0.05)；H組孕鼠第21天的體重極明顯低于Veh組(P<0.01)。

表1 P代孕鼠體重(均值±SD) （g）

2.2.2 P代母鼠哺乳期體重 由表2可知，P代哺乳母鼠：L組體重與Veh組比較，無明顯差異(P>0.05)；M組第9天的體重顯著低于Veh組(P<0.05)。

表2 P代母鼠哺乳期體重(均值±SD) (g)

2.2.3 P代仔鼠(F)代哺乳期體重 由表3可知，P代仔鼠(F1代)哺乳期：L組雄仔鼠第3、9、12、15和21天的體重顯著或極顯著低于Veh組(P<0.05或P<0.01)；M組雄仔鼠第0～21天的體重極顯著低于Veh組(P<0.01)。L組雌仔鼠的體重與Veh組比較，無明顯差異(P>0.05)；M組雌仔鼠第0～21天的體重極顯著低于Veh組(P<0.01)。

表3 P代仔鼠(F1代)哺乳期體重(均值±SD) (g)

2.2.4 斷奶后F1代雄鼠體重 由表4可知，F(xiàn)1代雄鼠：L組第3～12周的體重顯著或極顯著低于Veh組(P<0.05或P<0.01)；M組第0～12周的體重極顯著低于Veh組(P<0.01)。

2.2.5 斷乳后F1代雌鼠體重 由表5可知，F(xiàn)1代雌鼠：L組第5～8周的體重顯著低于Veh組(P<0.05)；M組第0～12周的體重極顯著低于Veh組(P<0.01)。

表4 斷乳后F1代雄鼠體重(均值±SD) (g)

表5 斷乳后F1代雌鼠體重(均值±SD) (g)

2.2.6 F1代孕鼠體重 由表6可知，F(xiàn)1代孕鼠：L組體重與Veh組比較差異不顯著(P>0.05)；M組第0～15天的體重極顯著低于Veh組(P<0.01)。

表6 F1代孕鼠體重(均值±SD) (g)

2.3 動(dòng)物攝食量

2.3.1 P代孕鼠 L和M組孕鼠的攝食量與Veh組比較，無明顯差異(P>0.05)；H組孕鼠第18天和第19天的攝食量極顯著低于Veh組(P<0.01)。

2.3.2 P代哺乳母鼠 L組孕鼠第9、15天的攝食量顯著或極顯著低于Veh組(P<0.05或P<0.01)；M組孕鼠第3～15天的攝食量極顯著低于Veh組(P<0.01)。

2.3.3 F1代雄鼠 L組雄鼠第5、6周的攝食量顯著低于Veh組(P<0.05)；M組雄鼠第1～13周的攝食量極顯著低于Veh組(P<0.01)。

2.3.4 F1代雌鼠 L組雌鼠的攝食量與Veh組比較，無明顯差異；M組雌鼠第1～13周的攝食量極顯著低于Veh組(P<0.01)。

2.3.5 F1代孕鼠 L組孕鼠的攝食量與Veh組比較，無明顯差異；M組孕鼠第3～15天的攝食量極顯著低于Veh組(P<0.01)。

2.4 P代母鼠妊娠率、孕鼠死亡率

Veh、L、M和H組P代母鼠妊娠率分別為：95.7%、95.5%、95.5%、100.0%；Veh、L、M和H組P代孕鼠死亡率均為0%，各給藥組P代母鼠妊娠率、孕鼠死亡率與Veh組比較，無明顯差異(P>0.05)。

2.5 P代活仔鼠(F1代)外觀畸形率、出生存活率、哺乳成活率、身體發(fā)育和反射發(fā)育

（1）Veh、L和M組的仔鼠的外觀畸形率分別為6.47%、10.32%和86.41%；Veh、L和M組的仔鼠的出生存活率分別為：98.06%、98.41%和49.51%；Veh、L和M組的仔鼠的哺乳成活率分別為：99.43%、100.00%和95.74%。（2）L組P代仔鼠(F1代)的外觀畸形率、出生存活率和哺乳成活率與Veh組比較，無明顯差異(P>0.05)；M組P代仔鼠(F1代)的哺乳成活率與Veh組比較，無明顯差異(P> 0.05)；M組P代仔鼠(F1代)的外觀畸形率極顯著高于Veh組(P<0.01)；M組P代仔鼠(F1代)的出生存活率極顯著低于Veh組(P<0.01)。（3）Veh組動(dòng)物的身體發(fā)育指標(biāo)和全部反射發(fā)育的時(shí)間都在正常范圍內(nèi)。L組動(dòng)物包皮分離和斷崖回避指標(biāo)與Veh組比較顯著延遲(P<0.05)；M組動(dòng)物睜眼、腹毛生出、包皮分離、陰道張開、觸須定位和視覺定位指標(biāo)與Veh組比較顯著或極顯著提前或延遲(P<0.05或P<0.01)。（4）各給藥組動(dòng)物轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)結(jié)果和穿梭箱試驗(yàn)結(jié)果與Veh組比較，無明顯差異(P>0.05)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中SD大鼠給予溶媒和環(huán)磷酰胺低、中、高劑量后，各給藥組對(duì)大鼠圍產(chǎn)期都有毒性作用，其中H組毒性最強(qiáng)，F(xiàn)1代動(dòng)物全部死亡；M組毒性明顯，對(duì)P代雌鼠和F1代大鼠的各種指標(biāo)幾乎都產(chǎn)生了極強(qiáng)的毒性作用，特別是造成F1代大鼠的牙齒畸形；L組毒性較輕，對(duì)P代雌鼠和F1代大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了較輕的毒性作用，且未造成F1代大鼠嚴(yán)重的畸形。

綜上所述，環(huán)磷酰胺低、中、高劑量組均可見對(duì)SD大鼠圍產(chǎn)期具有明顯的毒性作用，并具有一定的量效關(guān)系。

[1]袁伯俊, 廖明陽, 李波. 藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)[M]. 北京化學(xué)工業(yè)出版社, 2007.

[2]王新禹, 梁前進(jìn). 環(huán)磷酰胺的毒副作用機(jī)制及應(yīng)對(duì)作用措施[J].藥學(xué)進(jìn)展, 2006. 30(10): 452-456.

[3]《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則. 北京: 2006.11.

[4]王新禹, 梁前進(jìn). 環(huán)磷酰胺的毒副作用機(jī)制及應(yīng)對(duì)作用措施[J].藥學(xué)進(jìn)展, 2006.30(10): 452-456.

[5]袁偉杰, 黃潔波. 環(huán)磷酰胺對(duì)兩性生殖系統(tǒng)毒性損傷的臨床研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志. 2010.11(7): 568-570.