倪兆林，王 濤，張 玲，林麗佳，楊冠英，張 義，申元英*

（1.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

洱海水華銅綠微囊藻生長特性的初步研究

倪兆林1，王 濤2，張 玲1，林麗佳1，楊冠英1，張 義2，申元英1*

（1.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：分離純化出洱海主要的優(yōu)勢銅綠微囊藻并觀察其生長規(guī)律及特性。方法：采用水滴-涂布平板法分離純化銅綠微囊藻，采用90%的丙酮提取葉綠素，酶標(biāo)儀測定其含量，用顯微鏡計數(shù)藻細(xì)胞的個數(shù)。結(jié)果：銅綠微囊藻細(xì)胞密度與OD665呈直線關(guān)系，R2=0.993 1，藻細(xì)胞的增長速率在第6天達(dá)到最大值為0.524，其葉綠素及類胡蘿卜素的含量隨時間的變化而逐步升高。結(jié)論：此銅綠微囊藻的生長符合“S”型曲線，藻細(xì)胞密度與吸光度成線性相關(guān)，其生長速率在第6天達(dá)到最大。

洱海；銅綠微囊藻；分離；生長曲線；葉綠素a

洱海位于云貴高原西部，大理白族自治州境內(nèi)，全湖面積246 km2，平均水深10.5 m，容積27.7億m3，為云南省第二大淡水湖泊〔1〕，是大理州生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會發(fā)展的基礎(chǔ)條件〔2〕。近年來隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類對洱海開發(fā)活動的不斷加劇，洱?，F(xiàn)正處于中營養(yǎng)水平向富營養(yǎng)湖泊的過渡階段〔3〕，洱海藍(lán)藻水華自1996年9月在洱海首次大面積發(fā)生以來，每年夏秋季都會頻繁地在大部分湖灣發(fā)生〔4〕。盡管近兩年加大了對洱海的治理，但藍(lán)藻水華依然是困擾洱?？沙掷m(xù)發(fā)展的重要問題。微囊藻水華是洱海常見的藍(lán)藻水華，其爆發(fā)嚴(yán)重影響了洱海多種功能的正常發(fā)揮。因此，研究洱海主要的微囊藻屬銅綠微囊藻的生長規(guī)律及其特征，為進(jìn)一步有效地分離溶藻細(xì)菌以控制水華的發(fā)生具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 藻種及其分離純化藻種于2011年7月采自大理洱海微囊藻爆發(fā)期間，用高溫滅菌的毛細(xì)吸管吸取稀釋適度的藻液，滴到已消毒的載玻片上，藻液水滴盡可能小些，要求在顯徽鏡低倍鏡視野中能看到水滴的全部或大部。1片載玻片滴2～3滴，水滴直線排列，互相間隔一定距離。在顯微鏡下詳細(xì)觀察每一滴藻液〔5〕，如果一滴藻液內(nèi)只有一個或幾個所需要分離的同種藻類細(xì)胞，無其他生物混雜，即用BG11培養(yǎng)液把這一滴藻液沖入BG11固體平板表面，涂布培養(yǎng)2～3 d，反復(fù)幾次后形態(tài)觀察確定為銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）單克隆藻株，即可挑取單藻株到BG11液體培養(yǎng)液中逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，用作實驗材料。

1.2 藻種的培養(yǎng)藻種在自然條件下采用藻類通用BG11培養(yǎng)基：1 000 mL去離子水中加入NaNO3：1.500 g；MgSO4·7H2O：0.075 g；Na2SiO3·9H2O：0.058 g；Ferric ammonium citrate：0.006 g；Na2CO3：0.020 g；K2HPO4：0.040g；CaCl2·2H2O：0.036g；Citricacid：0.006 g；EDTA：0.001 g；A5solution＋Co：0.001 g。

A5solution＋Co微量元素的配制：1 000 mL去離子水中加入H3BO3：2.860 g；ZnSO4·7H2O：0.222 g；Na2MoO4·2H2O：0.039 g；MnCl2·4H2O：1.810 g；CuSO4· 5H2O：0.079 g；Co（NO3）2·6H2O：0.049 g。

藻固體培養(yǎng)基為BG11液體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。

1.3 銅綠微囊藻生長曲線的測定取上述分離好的銅綠微囊藻培養(yǎng)液接入100 mL三角瓶中，內(nèi)裝50 mL藻培養(yǎng)液，自然條件下，每天固定時間搖床震蕩培養(yǎng)2 h并定時取樣測定665 nm處〔6〕的吸光度值，顯微鏡計數(shù)培養(yǎng)液中藻細(xì)胞的個數(shù)（n），以時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.4 銅綠微囊藻生物量的測定及日增長率的計算按照“1.3”的方法制備觀察藻液體，每天定時取樣測定665 nm處藻細(xì)胞懸浮液吸光度表示細(xì)胞生物量。依下式〔7〕計算日增長速率：

式中：μ為日增長率，Nt為藻類當(dāng)天生物量，Nt-1為藻類前一天的生物量。

1.5 葉綠素a（Chla）、類胡蘿卜素（CAR）含量的測定取預(yù)培養(yǎng)5 d的銅綠微囊藻液，每天定時取樣（1 mL/次），4 500 r/min，離心10 min，棄去上清液，加入等體積90%（v/v）的丙酮，混合均勻，將混勻的液體放置在4℃黑暗條件下抽提24 h，然后再離心10min，取上清，用酶標(biāo)儀分別測定在665nm、649nm、480 nm處的吸光度，計算其葉綠素a（μg/mL）、類胡蘿卜素（mg/mL）的含量，然后以時間為橫坐標(biāo)，含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算公式〔8-9〕分別為式

2 結(jié)果

2.1 銅綠微囊藻細(xì)胞密度與吸光度值的相關(guān)性由圖1可知藻細(xì)胞的密度與665 nm處的吸光度值呈直線關(guān)系，R2=0.993 1，在一定的范圍內(nèi)，藻細(xì)胞的數(shù)量是隨著吸光值的增加而增加的。因此，通過對藻液吸光度值的測定，可知藻細(xì)胞的數(shù)量，同時也可通過測定藻溶液的光密度值來代表銅綠微囊藻的生長情況。

圖1 藻細(xì)胞密度與吸光度值得相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 銅綠微囊藻的生長曲線將預(yù)先饑餓培養(yǎng)的銅綠微囊藻稀釋后在自然條件下生長，測定其OD665值并繪制生長曲線如圖2所示，由圖中可以看出此株銅綠微囊藻的生長符合“S”型曲線，在生長的前4 d為生長調(diào)整期，增長較緩慢，4 d以后進(jìn)入對數(shù)期，在第6天達(dá)到最大日增長速率為0.524，16 d以后進(jìn)入衰亡期。

圖2 銅綠微囊藻的生長曲線

2.3 葉綠素a隨時間的變化曲線此株銅綠微囊藻在初始OD665為0.213，初始葉綠素a含量為0.435 μg/mL時的葉綠素a含量變化曲線如圖3所示，由圖可知此株銅綠微囊藻葉綠素a的含量隨時間的增加而增高，當(dāng)微囊藻生長到第12天之后其葉綠素a的含量變化不明顯。

圖3 銅綠微囊藻的葉綠素a含量變化曲線

2.4 類胡蘿卜素的含量變化此株銅綠微囊藻在初始OD665為0.213時的類胡蘿卜素含量變化曲線如圖4所示，由圖可知在前8 d類胡蘿卜素含量呈對數(shù)變化，但隨后逐漸減慢。

圖4 銅綠微囊藻類胡羅卜素的含量變化曲線

3 討論

最常見洱海水華藍(lán)藻能形成群落的優(yōu)勢種〔4〕有：銅綠微囊藻、螺旋魚腥藻（Anabaena spiroides）、水華束絲藻（Aphani jomenonflos-aquae）等，而銅綠微囊藻、螺旋魚腥藻是形成水華、影響水功能的重要物種。洱海藻類爆發(fā)的時間為11月至翌年3月，3～4月水華束絲藻成為洱海優(yōu)勢種，4～7月微囊藻爆發(fā)，7～11月魚腥藻爆發(fā)，其演替方向是硅藻和綠藻—水華束絲藻—微囊藻—魚腥藻—硅藻和綠藻〔10〕，所以本研究于7月份采集的為微囊藻屬。結(jié)果表明銅綠微囊藻的生長符合“S”型曲線，有明顯的增長期、對數(shù)區(qū)、穩(wěn)定區(qū)和衰亡期。實驗中通過研究其銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度與665 nm處的吸光度值的關(guān)系可知它們呈直線相關(guān)，藻細(xì)胞的數(shù)量隨著吸光度的增加而增加，這與牛丹丹的報道〔11〕相似，我們可以通過測定藻液吸光度值，推測藻細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而推測藻細(xì)胞的生長速度。

通過計算后發(fā)現(xiàn)此株銅綠微囊藻在第6天的增長速率達(dá)到最大為0.524，同時觀察此時的葉綠素a、類胡蘿卜素的含量變化和在665 nm處藻液的吸光度值發(fā)現(xiàn)，此時藻細(xì)胞正處于生長對數(shù)期接近穩(wěn)定區(qū)，符合藻細(xì)胞的生長規(guī)律，以后藻細(xì)胞的增長逐漸減慢，而葉綠素及類胡蘿卜素的含量趨近平衡。可能的原因為營養(yǎng)物質(zhì)用盡，藻毒素分泌太多造成這種情況，具體的原因正在研究。

〔1〕潘曉潔，常鋒毅，康麗娟，等.洱海魚腥藻優(yōu)勢種的形態(tài)鑒定與16S rRNA基因序列分析〔J〕.武漢植物學(xué)研究，2008，26（3）：229-234.

〔2〕杜寶漢.淺析洱海生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展〔J〕.生態(tài)經(jīng)濟(jì)，1999（4）：56-58.

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〔4〕王蕓.洱海夏秋季藍(lán)藻種群動態(tài)變化及水華成因分析〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報，2008，7（12）：39-42.

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〔11〕牛丹丹，鄭青松，劉兆普，等.溶藻細(xì)菌YZ對銅綠微囊藻的溶藻特性研究〔J〕.中國環(huán)境科學(xué)，2011，31（2）：321-326.

A Study on the Growth and Some Physiological Characteristics of Microcystis aeruginosa Isolated from Erhai Lake

NI Zhaolin1,WANG Tao2,ZHANG Ling1,LIN Lijia1,YANG Guanying1,ZHANG Yi2,SHEN Yuanying1*
（1.College of Public Health,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study on the growth law and some physiological characteristics of Microcystis aeruginosa isolated from Erhai lake.Methods:Purified Microcystis aeruginosa was separated with water droplets method and the spread plate method.Microscopic was used to count the density of algal cells；chlorophyll and carotenoid were extracted with 90%acetone and ELIASA determination of its content.Results:Microcystis aeruginosa cells density was in a linear relationship with OD665,R2=0.993 1；algal cell growth rate in sixth days reached a maximum of 0.524；chlorophyll and carotenoid content increased gradually over time.Conclusion:This Microcystis aeruginosagrowth is in line with the“S”shaped curve；cell density and absorbance is linearly related and the growth rate of the maximum on the sixth day.

Erhai lake；Microcystis aeruginosa；isolate；growth curve；chlorophyll a

Q939.9

A

1672-2345（2013）04-0048-03

云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項目（2012J045）；大理學(xué)院洱海保護(hù)研究專項課題基金資助項目（KYRH201005）

2012-09-15

2012-10-05

倪兆林，碩士研究生，主要從事流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)研究.

（責(zé)任編輯 毛本勇）

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.04.013

*通信作者：申元英，教授.