陳聃　時(shí)浩杰等

摘 要： 【目的】了解浙江地區(qū)葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）對(duì)苯并咪唑類殺菌劑和甾醇脫甲基抑制劑（DMI）類殺菌劑的抗藥性現(xiàn)狀，為其防治提供依據(jù)和指導(dǎo)。【方法】采用區(qū)分劑量法測(cè)定了浙江省臨安市、諸暨市和金華市的3個(gè)葡萄重要產(chǎn)區(qū)的108個(gè)葡萄炭疽病菌株對(duì)甲基硫菌靈和戊唑醇的抗藥性，并對(duì)甲基硫菌靈敏感和抗藥性菌株中的β-tubulin基因進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序和比較?！窘Y(jié)果】所采集菌株群體對(duì)甲基硫菌靈的抗藥性頻率為37.04%，且均為高水平抗藥性菌株（Ben HR），Ben HR對(duì)多菌靈和乙霉威表現(xiàn)雙重抗藥性，其β-tubulin基因的第200位密碼子從TTC突變?yōu)門AC，導(dǎo)致第200位氨基酸從苯丙氨酸（Phe）突變?yōu)榻j(luò)氨酸（Tyr）。所采集菌株群體共檢測(cè)到33個(gè)（30.56%）對(duì)戊唑醇表現(xiàn)低水平抗藥性的菌株?！窘Y(jié)論】浙江地區(qū)葡萄炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈、乙霉威產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，對(duì)DMIs類殺菌劑戊唑醇的抗藥性發(fā)展迅速。

關(guān)鍵詞： 葡萄炭疽病菌； 甲基硫菌靈； 乙霉威； 戊唑醇； 抗藥性； β-tubulin基因

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0665-04

葡萄是我國(guó)重要的果樹(shù)，近10年栽培面積和產(chǎn)量一直呈上升趨勢(shì)[1]。浙江省地理位置優(yōu)越，葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，到2010年，全省已有葡萄栽培面積2萬(wàn)hm2以上。葡萄作為重要的果樹(shù)經(jīng)濟(jì)作物，已成為浙江省農(nóng)民增收的重要渠道。

葡萄炭疽病是葡萄上重要的真菌病害之一。膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.）是引起該病的病原菌之一，有性世代屬于子囊菌亞門，子囊菌綱，球殼菌目，小叢殼屬的圍小叢殼菌（Glomerel ciagulata （Ston） Spauld et schrenk），自然條件下罕見(jiàn)[2]。膠孢炭疽菌的寄主廣泛，不同的專化型可以侵染多種不同的作物，如香蕉、杧果、辣椒、草莓、蘋果、桃等[2-6]，且因與寄主之間協(xié)同進(jìn)化和受環(huán)境影響如農(nóng)藥等因素的作用，產(chǎn)生的變異相對(duì)較多，也較快。因此，對(duì)這些變化的跟蹤和研究也非常有必要，國(guó)內(nèi)外也有很多相關(guān)研究[4]。

目前生產(chǎn)上用于葡萄炭疽病防治的主要藥劑有苯并咪唑類的多菌靈和甲基硫菌靈，甾醇脫甲基抑制劑類（DMIs）的戊唑醇和咪鮮胺等。國(guó)內(nèi)外在很多種致病真菌上已有關(guān)于對(duì)苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道，如小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）[7-8]和灰霉病菌（Botrytis cinerea）[9]。國(guó)內(nèi)，葉佳等[10]報(bào)道的浙江省葡萄炭疽病菌已對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，但具體抗性機(jī)制還不清楚。葉佳等[9]報(bào)道浙江省葡萄炭疽病菌已對(duì)戊唑醇出現(xiàn)了敏感性分化，但進(jìn)一步的發(fā)展情況還有待研究。

本研究定性測(cè)定了從浙江省葡萄重要產(chǎn)區(qū)采集的108株葡萄炭疽病菌株對(duì)甲基硫菌靈、多菌靈·乙霉威和戊唑醇的敏感性，并研究了葡萄上膠孢炭疽菌的對(duì)甲基硫菌靈的抗性分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 菌株的采集、分離和鑒定

1.2 供試藥劑

1.3 對(duì)甲基硫菌靈的抗藥性檢測(cè)

1.4 甲基硫菌靈抗性菌株對(duì)多菌靈·乙霉威的雙重抗藥性測(cè)定

1.5 葡萄炭疽病菌β-tubulin基因序列的擴(kuò)增和測(cè)序

選取對(duì)甲基硫菌靈的敏感性菌株和抗性菌株各4株，在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，用滅過(guò)菌的載玻片刮取菌絲，放入滅過(guò)菌的研缽中。在研缽中加入適量液氮并研磨成粉末狀。DNA提取采用真菌基因組DNA快速抽提取試劑盒（SK2082）（上海生工）。引物序列根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的引物序列，TubGF（5-TCTCGATGT-TATCCGCCG-3），TubGR （5-TGAGCTCAGGAACACTGACG-3） [11]，由上海生工生物合成。PCR擴(kuò)增采用即用PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工）。PCR 參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，然后經(jīng)94 ℃變性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，最后 72 ℃延伸5 min[11]。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳，割膠純化回收后，直接送上海生工測(cè)定，結(jié)果用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.6 對(duì)DMI類殺菌劑戊唑醇的抗藥性檢測(cè)

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的抗藥性頻率

2.2 對(duì)多菌靈和乙霉威的雙重抗藥性

2.4 葡萄炭疽病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性頻率

3 討 論

對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性菌株主要有兩種類型： Ben R1和Ben R2。在苯并咪唑類殺菌劑使用以前，田間菌株為Ben S，Ben S菌株對(duì)苯并咪唑類殺菌劑敏感、同時(shí)對(duì)乙霉威表現(xiàn)抗藥性（二者之間存在負(fù)交互抗藥性）；苯并咪唑類殺菌劑大量連續(xù)使用以后，田間開(kāi)始出現(xiàn)Ben R1菌株。Ben R1對(duì)苯并咪唑類殺菌劑表現(xiàn)為高水平抗藥性，但對(duì)乙霉威敏感。于是多菌靈和乙霉威的復(fù)配制劑被大量用于對(duì)Ben R1的治理，田間開(kāi)始出現(xiàn)Ben R2菌株[12-13]。Ben R2菌株表現(xiàn)為抗苯并咪唑類殺菌劑，同時(shí)對(duì)乙霉威表現(xiàn)抗藥性，即雙重抗藥性菌株[12]。

本研究檢測(cè)了浙江省葡萄產(chǎn)區(qū)臨安、諸暨和金華3地葡萄炭疽菌群體對(duì)苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈的抗藥性。從研究結(jié)果看，以上三地的葡萄炭疽病菌已對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生了較嚴(yán)重的抗藥性，抗性頻率37.04%。膠孢炭疽菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的高頻率抗性會(huì)導(dǎo)致苯并咪唑類殺菌劑對(duì)葡萄炭疽病的防治效果下降[14-15]。鑒于多菌靈和甲基硫菌靈有正交互抗性，因此認(rèn)為這三個(gè)地區(qū)在葡萄上應(yīng)減少使用苯并咪唑類藥劑。并且此類菌株對(duì)多菌靈·乙霉威也產(chǎn)生了抗性，即為雙重抗藥性菌株。說(shuō)明臨安、諸暨和金華3地的葡萄炭疽菌群體對(duì)咪唑類殺菌劑已產(chǎn)生Ben R2抗性類型。

供試菌株中30.56%對(duì)戊唑醇產(chǎn)生低水平抗藥性，這與葉佳等[9]2011年采集的浙江省78個(gè)葡萄炭疽病菌株中2個(gè)菌株對(duì)戊唑醇的敏感性明顯較低的報(bào)道相比，抗性水平迅速提高，敏感性分化更為明顯，說(shuō)明在浙江省此類藥劑的抗性發(fā)展較快，因此為延緩對(duì)戊唑醇抗藥性的產(chǎn)生[15]，筆者建議使用不同作用位點(diǎn)的殺菌劑與對(duì)此類藥劑混用或交替使用。

4 結(jié) 論

浙江省臨安、諸暨等地區(qū)葡萄炭疽病菌已對(duì)甲基硫菌靈、乙霉威產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的抗藥性，抗性機(jī)制為β-Tubulin基因密碼子第200位苯丙氨酸（Phe）變?yōu)榻j(luò)氨酸（Tyr），建議該地區(qū)減少使用這兩類殺菌劑，否則會(huì)因用量過(guò)大造成環(huán)境污染；與之前報(bào)道相比，浙江省葡萄炭疽病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性水平發(fā)展迅速，建議生產(chǎn)中盡量避免此類藥劑單一，以延緩對(duì)此類殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生。

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