潘學(xué)軍　李霞　張文娥

摘 要： 【目的】為闡明緩慢生長法離體保存野生毛葡萄試管苗的機(jī)制，【方法】以野生毛葡萄‘花溪-9為試材，利用緩慢生長法成功離體保存了供試材料試管苗，并從葉片解剖結(jié)構(gòu)和生理生化變化2個方面闡述了毛葡萄試管苗離體保存存活率與葉片結(jié)構(gòu)和抗氧化酶活性間的關(guān)系。【結(jié)果】溫度、光照和烯效唑（S3307）對野生毛葡萄離體保存效果均有影響，其影響順序?yàn)镾3307>溫度>光照，且3因素兩兩之間互作效應(yīng)明顯。野生毛葡萄在低溫（10±2）℃、光照10 μmol·m-2·s-1（12 h·d-1）和添加0.1 mg·L-1 S3307的1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+ 3%蔗糖+0.5%瓊脂粉的培養(yǎng)基上保存效果良好，存活率可達(dá)86.33%。離體保存存活率較高的試管苗葉綠素含量和膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量較低，保護(hù)酶（SOD、CAT、POD）活性強(qiáng)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白含量高，葉肉細(xì)胞的緊密度提高，單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多。【結(jié)論】適宜的離體保存方法增加了毛葡萄葉肉細(xì)胞的緊密度，提高了試管苗的抗氧化能力，這可能是緩慢生長法離體保存成功的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞： 毛葡萄； 緩慢生長法； 生理響應(yīng)； 結(jié)構(gòu)變化； 種質(zhì)保存

中圖分類號：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0615-06

種質(zhì)資源是物種進(jìn)化、遺傳學(xué)研究及育種工作的物質(zhì)基礎(chǔ)，隨著人類生產(chǎn)實(shí)踐活動的不斷深入和氣候的異常變化，大量資源遭到了破壞，甚至滅絕，種質(zhì)資源保護(hù)已成為一項(xiàng)世界性課題[1-5]。田間種植保存費(fèi)用高，且仍面臨著資源損失的危險；種子庫保存則對有性繁殖困難的果樹資源無能為力[5]。自離體保存策略[6-7]提出以來，該項(xiàng)技術(shù)受到了果樹科學(xué)工作者的高度重視，已成功應(yīng)用到多種果樹種質(zhì)資源的保存中[8-12]。目前關(guān)于果樹種質(zhì)資源離體保存研究主要集中在保存方法的探索、改良及遺傳穩(wěn)定性檢測方面[12-18]，較少見到離體保存過程中保存材料的生理機(jī)制變化方面的研究，而探討離體保存材料的生理變化機(jī)制與離體保存條件的關(guān)系，可深入了解離體保存的機(jī)制，有針對性地調(diào)整保存條件，增強(qiáng)方法探索中的針對性。本文以中國野生毛葡萄優(yōu)株‘花溪-9為試材，研究了不同離體保存條件下‘花溪-9保存10個月后的相關(guān)形態(tài)和生理指標(biāo)變化，并探討了離體保存存活率和各項(xiàng)指標(biāo)間的關(guān)系，以期探討野生毛葡萄離體保存過程中生理響應(yīng)機(jī)制，為野生毛葡萄離體保存提供科學(xué)的方法；并為探討果樹資源離體保存機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以野生毛葡萄（Vitis heyneana Roem. & Schult ）優(yōu)株‘花溪-9離體快速繁殖的組培苗為試材。試驗(yàn)于2009—2010年在貴州省果樹工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計與離體保存保存方法

1.3 離體保存植株的生長及生理指標(biāo)測定

1.4 葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察

選取保存效果最好的葉片進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)觀察，以T0為對照。剪取葉柄上方1 cm處長約5 mm葉片小塊，立即放入FAA溶液中固定；采用常規(guī)制片法制片，在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察，并用Motic Image Advances3.2軟件采集圖片并測量單位面積柵欄組織和海綿組織細(xì)胞個數(shù)。30次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SAS分析軟件進(jìn)行多因素方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體保存對毛葡萄存活率及植株生長狀況的影響

離體保存效果的好壞取決于離體保存時間的長短和保存存活率的高低。離體保存條件下，植株存活率高，生長相對緩慢，保存時間較長，則適合該物種離體保存。由表2可見，與對照相比，離體保存10個月后，毛葡萄的存活率不同程度的下降，但不同方法間差異很大，其存活率高低順序?yàn)門1>T4>T2>T6>T7>T8>T5>T3>T9。結(jié)合植株生長情況來看（圖版-T0～T9），在T1保存條件下，保存存活率最高，且植株生長相對緩慢，保存效果最優(yōu)；其次是T2、T4和T7，但3者的長勢略強(qiáng)；盡管T8的存活率略低，但在此條件下，毛葡萄生長較為緩慢，也可用于毛葡萄的離體保存。多因素分析表明，光照、溫度及生長抑制劑S3307對野生毛葡萄存活率和生長勢均有顯著的影響，且不同的因素間互作效應(yīng)顯著；3個影響因素中S3307的影響最為明顯，其次是溫度，光照的影響相對較?。ńY(jié)果未列出）。

2.2 毛葡萄離體保存對生理特性的影響

2.2.2 離體保存條件下毛葡萄葉片丙二醛含量變化 由圖2可見，不同的離體保存條件下毛葡萄葉片內(nèi)MDA含量差異很大。與對照相比，T1、T2、T8保存條件下，葉片MDA含量有所降低，而其他6個保存條件下葉片內(nèi)MDA含量不同程度的上升，其中T3、T9條件下，葉片MDA含量升高幅度最大。盡管MDA含量高低與離體保存存活率并非一一對等關(guān)系，但是，存活率較高的保存方法，如T1，其葉片MDA含量較低；保存效果較差的方法，葉片MDA含量也較高，如T3、T9。

2.4 離體保存存活率與生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由表4可見，離體保存存活率與葉綠素含量和MDA含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但均未達(dá)到顯著性水平，說明葉綠素、MDA含量較低的情況下，存活率有升高的趨勢，但二者間相關(guān)性不強(qiáng)。存活率與葉片內(nèi)保護(hù)性酶（SOD、POD、CAT）活性和可溶性蛋白質(zhì)含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明葉片內(nèi)保護(hù)酶活性越強(qiáng)，可溶性蛋白含量越高，存活率越高。而SOD、POD、CAT活性和可溶性蛋白含量兩兩之間均表現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系，葉綠素含量與SOD活性和可溶性蛋白含量顯著負(fù)相關(guān)，表明離體保存條件下，毛葡萄葉片SOD、POD、CAT活性和可溶性蛋白含量4者之間高度正向協(xié)同變化。而綠葉素含量與SOD活性和可溶性蛋白含量則高度負(fù)協(xié)同變化。

3 討 論

緩慢生長保存是一種中期保存方法，影響保存效果的因素很多，但主要是培養(yǎng)條件（光照和溫度）和培養(yǎng)基組分[21-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫（10±2）℃和光照10 μmol·m-2·s-1（12 h·d-1）條件下，毛葡萄帶頂芽的莖段接種到添加0.1 mg·L-1 S3307的1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+ 3%蔗糖+0.5%瓊脂粉的培養(yǎng)基上不需繼代保存10個月，存活率可達(dá)86.33%。多因素分析表明光照、溫度及生長抑制劑S3307對野生毛葡萄存活率和生長勢均有顯著的影響，這與前人的研究結(jié)果相一致[12，14-15，17]。不同的因素間互作效應(yīng)顯著，3個影響因素中S3307的效果最為明顯，其次是溫度，光照的影響相對較小。

離體保存過程中，低濃度（0.1 mg·L-1）植物生長延緩劑（烯效唑）可有效減緩毛葡萄試管苗生長，利于離體保存，而高濃度烯效唑（1.0～2.0 mg·L-1）對毛葡萄試管苗生長存在毒害作用，不利于離體保存，這與李朝周等[14]對葡萄栽培品種的保存濃度有所差異；低溫條件下葉綠素和蛋白質(zhì)合成代謝過程中部分酶活性受到一定程度的抑制，葉綠素和蛋白質(zhì)合成速率降低，導(dǎo)致葉綠素含量的降低和生長速率的減緩；組培條件下，試管苗生長主要依靠異養(yǎng)條件，但自養(yǎng)能力同樣存在，光照條件的減弱進(jìn)一步抑制了試管苗的光合作用，從而進(jìn)一步延緩了試管苗的生長，延長保存時間[17]，因此低溫和弱光也是毛葡萄試管苗離體保存的可行途徑。

對于果樹種質(zhì)資源離體保存研究多集中在保存方法的優(yōu)化和遺傳穩(wěn)定性檢測上[11-12，18]，果樹種質(zhì)保存過程中生理代謝及細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)變化方面的研究相對較少，也未見離體保存影響因素與生理指標(biāo)的關(guān)系研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照相比，離體保存10個月后的野生毛葡萄生理狀態(tài)發(fā)生了改變，存活率較高的配方（如T1）下的試管苗葉綠素含量和膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量較低，保護(hù)酶（SOD、CAT、POD）活性強(qiáng)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白含量高；反之，存活率較低的離體保存條件下（如T9）的試管苗葉綠素含量和MDA含量較高，保護(hù)酶活性弱，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白含量低。

離體保存存活率與葉綠素含量、MDA含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)未達(dá)顯著水平，而與保護(hù)酶活性和可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。說明離體保存條件下，葉片生理狀態(tài)影響離體保存效果，離體保存過程中，葉綠素含量的適度降低，可減弱光合代謝，利于離體保存；而保護(hù)酶活性和可溶性蛋白含量的升高，可有效抑制活性氧產(chǎn)生，使膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA維持在較低的水平，從而提高了離體保存存活率。這與膜質(zhì)過氧化水平低和保護(hù)酶活性高有利于種子保存的結(jié)論相一致[25-26]。本研究還發(fā)現(xiàn)離體保存條件下，試管苗葉肉細(xì)胞的緊密度發(fā)生了改變，單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多，由此推斷這種細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的變化可提高試管苗的抗逆性，利于離體保存。

本研究中僅研究了野生毛葡萄‘花溪-9離體保存下的組織結(jié)構(gòu)及生理響應(yīng)，不同基因型果樹離體保存條件差異很大，離體保存條件下其他果樹的生理和形態(tài)響應(yīng)機(jī)制需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

野生毛葡萄在低溫（10±2）℃、光照10 μmol·m-2 ·s-1 （12 h·d-1）和添加0.1 mg·L-1 S3307的1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+3%蔗糖+0.5%瓊脂粉的培養(yǎng)基上保存效果好，存活率可達(dá)86.33%。適宜的離體保存方法增加了野生毛葡萄葉肉細(xì)胞的緊密度，提高了試管苗的抗氧化能力，這可能是緩慢生長法離體保存成功的重要機(jī)制之一。（本文圖版見封底）

參考文獻(xiàn) References：

[1] ENGELMANN F. In vitro germplasm conservation[J]. Acta Horticulturae， 1998（46）： 141-147.

[2] ENGELMANN F. Use of biotechnologies for the conservation of plant biodiversity[J]. In Vitro Cellular and Development Biology Plant， 2011，47： 5-16.

[3] IUCN. IUCN Red List of Endangered Species[N]. In： http：//www. iucnredlist.org/. 2010.

[4] BARBARA M R， VISWAMBHARAN S， MICHAEL K， ERIC B， VALERIE C P. Biodiversity conservation and conservation biotechnology tools[J]. In Vitro Cellular and Development Biology Plant， 2011，47： 1-4.

[5] LU Xin-xiong， CHEN Xiao-ling. Progress of conservation and research of crop germplasm resources in China[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2003，36（10）： 1125-1132.

盧新雄，陳曉玲. 我國作物種質(zhì)資源保存與研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（10）： 1125-1132.

[6] HENSHAW G G. Technical aspects of tissue culture storage for genetic conservation[C]. In： Crop genetic resources for today and tomorrow. Cambridge University Press. Cambridge， Chap， 1975： 27.

[7] MOREL G. Meristem culture techniques for the long term storage of cultivated plants[C]. In： Crop genetic resources for today and tomorrow. Cambridge University Press，Cambridge， Chap，1975： 327-332.

[8] MA Feng-wang， LI Jia-rui. Cryopreservation of apricot protoplasts[J]. Acta Horticulturae Sinica， 1998，25（4）： 329-332.

馬鋒旺，李嘉瑞. 杏原生質(zhì)體的超低溫保存[J]. 園藝學(xué)報，1998，25（4）： 329-332.

[9] ZHAO Yan-hua， WU Yong-jie， ZHOU Ming-de. Cryopreservation of in vitro culture shoot tips of Prunus mahaleb[J]. Acta Horticulturae Sinica， 1999，26（6）： 402-403.

趙艷華，吳永杰，周明德. 馬哈利櫻桃離體超低溫保存的研究[J]. 園藝學(xué)報，1999，26（6）： 402-403.

[10] ZHAO Yan-hua， WU Yong-jie. Study on cryopreservation of in vitro cultured cabernet Franch shoot tips[J]. Acta Horticulturae Sinica，2001， 28（1）： 62-64.

趙艷華，吳永杰.‘品麗珠葡萄離體莖尖超低溫保存的研究[J]. 園藝學(xué)報，2001，28（1）： 62-64.

[11] WANG Zi-cheng， DENG Xiu-xin. Cryopreservation of citrus shoot-tips by vitrification and regeneration[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2001，28（4）： 301-306.

王子成，鄧秀新.玻璃化法超低溫保存柑橘莖尖及植株再生[J]. 園藝學(xué)報，2001，28（4）： 301-306.

[12] AI Peng-fei， LUO Zheng-rong. Conservation of in vitro shoots of persimmon and date plum by slow growth and genetic stability of recovered plantlets[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2004，31（4）： 441-446.

艾鵬飛，羅正榮. 柿和君遷子試管苗緩慢生長法保存及遺傳穩(wěn)定性研究[J]. 園藝學(xué)報，2004，31（4）： 441-446.

[13] PENG Min-zhang， DENG Jiu-sheng， GAN Lin. Preservation of anocado in vitro under low temperature[J]. Journal of Fruit Science， 1996，13（2）： 96-98.

彭民璋，鄧九生，甘霖. 油梨種質(zhì)的離體低溫保存[J]. 果樹科學(xué)，1996，13（2）： 96-98.

[14] LI Chao-zhou， LI Wei， CAO Zi-yi. The role of S3307 in the growth and preservation of grape tube seedlings[J]. Plant Physiology Communications， 1997，33（1）：18-20.

李朝周，李唯，曹孜義. S3307在葡萄試管苗生長和保存中的作用（簡報）[J]. 植物生理學(xué)通訊，1997，33（1）： 18-20.

[15] LIU Yue-xue， LIU Xiao-jun， WANG Jia-fu， LIN Shun-quan. Effects of low temperature and another condition on Eriobotryo japonica germplasm preservation in vitro[J]. Journal of Plant Resources and Environment， 2004，13（1）：28-31.

劉月學(xué)，劉小軍，王家福，林順權(quán). 低溫等因素對枇杷種質(zhì)離體保存的影響[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報，2004，13（1）： 28-31.

[16] NIU Ai-guo， ZHANG Kai-chun， ZHANG Xiao-ming， YAN Guo-hua， LI Wen-sheng， JIANG Li-jie. Preservation of in vitro growth shoot of cherry germplasm[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2005，32（2）： 298-300.

牛愛國，張開春，張曉明，閆國華，李文生，姜立杰. 櫻桃種質(zhì)資源試管苗保存方法[J]. 園藝學(xué)報，2005，32（2）： 298-300.

[17] TEHRIM S， SAJID G M. In vitro establishment， conservation and its implications for grape germplasm biodiversity[J]. Romanian Biotechnological Letters，2011，16（6）：6781-6789.

[18] ZHU Wen-tao，ZHOU Hou-cheng，WANG Zi-cheng. Cryopreservation of Fragaria pentapylla and analysis of genetic stability[J]. Journal of Fruit Science，2013，30（1）： 55-61.

朱文濤，周厚成，王子成. 五葉草莓超低溫保存及遺傳穩(wěn)定性分析[J]. 果樹學(xué)報，2013，30（1）： 55-61.

[19] ARNON D I. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris[J]. Plant Physiology， 1949，24： 1-15.

[20] GAO Jun-feng. Plant physiology laboratory technology[M]. Xian： World Publishing Corporation，2000.

高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].西安： 世界圖書出版社公司，2000.

[21] GOPAL J， CHAUHAN N S. Slow growth in vitro conservation of potato germplasm at low temperature[J]. Potato Research， 2010，53：141-149.

[22] LATA H， MORAES R M， BERTONI B， PEREIRA A M S. In vitro germplasm conservation of Podophyllum peltatum L. under slow growth conditions[J]. In vitro and Cellular and Development Biology-Plant， 2010，46： 22-27.

[23] NEGASH A， KRENS F， SCHAART J， VISSER B. In vitro conservation of enset under slow-growth conditions[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2001，66： 107-111.

[24] SCHERWINSKI-PEREIRA J E， COSTA F H S， CAMILLO J， SILVA D B， ALVES R B N， VIEIRA R F. Tissue culture storage of Brazilian medicinal plants germplasm[J]. Acta Horticulturae， 2010 （860）： 211-214.

[25] HU Jia-shu， ZHU Cheng， ZENG Guang-wen， ZHENG Guang-hua. Effect of aging-resistance of ultra-dried safflower seeds and its mechanism[J]. Acta Phytophysiologica Sinica， 1999，25（2）： 171-177.

胡家恕，朱誠，曾廣文，鄭光華. 超干紅花種子抗老化作用及其機(jī)理[J]. 植物生理學(xué)報，1999，25（2）： 171-177.

[26] ZHU Cheng，ZENG Guang-wen，ZHENG Guang-hua. The storage tolerance and lipid peroxidation in ultradried peanut seeds[J]. Acta Agronomica Sinica， 2000，26（2）： 235-238.

朱誠，曾廣文，鄭光華. 超干花生種子耐藏性與脂質(zhì)過氧化作用[J]. 作物學(xué)報，2000，26（2）： 235-238.