何紅春

（高郵市產品質量監(jiān)督檢驗所，江蘇 高郵225600）

1 引言

磺胺類（Sulfonamides，SAs）是具有對氨基苯磺酸苯磺酰結構的合成抗菌素的總稱，是合成的抑菌藥，對大多數革蘭氏陽性和許多革蘭氏陰性細菌有較強的抑制作用[1～7]，具有抗菌譜廣、性質穩(wěn)定、體內分布廣、制造不需糧食作原料、產量大、品種多、價格低、使用簡便、供應充足等優(yōu)點，目前仍是獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中最常用的藥物添加劑之一，在食源性動物的飼養(yǎng)中被廣泛應用。人類經常食用有磺胺類藥物殘留的動物源性食品，可能引起磺胺類藥物在體內的逐漸累積。其危害性主要表現為細菌耐藥性、過敏、造血紊亂、致癌作用以及激素樣作用等。目前中國、歐盟、美國、日本等均將磺胺類藥物列為動物飼養(yǎng)過程中限制使用的藥物。日本把磺胺類最大殘留限量從100μg/kg降為50μg/kg，歐盟規(guī)定牛奶和肉類食品磺胺類藥物總量≤100μg/kg[8]。美國規(guī)定牛奶中磺胺類藥物的MRLs為10μg/L。我國農業(yè)部2002年12月發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定牛奶中磺胺類藥物的最高殘留限量為0.1 mg/L[9]。

目前，針對磺胺類獸藥殘留的檢測方法有薄層色譜（TLC）、高效液相色譜（HPLC）法、液質聯用（HPLCMS、HPLC－MS/MS）、氣相色譜（GC）、氣質聯用（GC－MS、GC－MS/MS）；酶聯免疫吸附（ELISA）、膠體金免疫技術（Immune colloidal gold technique）和毛細管電泳（HPCE）法等。

2 作用機制和毒理學性質

磺胺類藥物作用的靶點為細菌的二氫葉酸合成酶，使其不能充分利用對氨基苯甲酸合成葉酸。二氫葉酸合成酶催化的是對氨基苯甲酸、谷氨酸及二氫蝶啶焦磷酸或對氨基苯甲酰谷氨酸與二氫蝶啶焦磷酸合成二氫葉酸的反應，二氫葉酸再經二氫葉酸還原酶作用還原生成四氫葉酸，四氫葉酸可進一步合成葉酸輔酶F，為細菌DNA中核苷酸的合成提供一碳單位。

磺胺藥與對氨基苯甲酸產生競爭性拮抗作用，從而阻止了細菌二氫葉酸的合成，進而抑制了細菌的生長繁殖。

大多數磺胺類藥物可廣泛滲入全身組織和細胞外液，能透過血腦屏障進入腦脊液。主要在肝臟內乙?；癁闊o抗菌活性代謝產物，但仍有磺胺類毒性，可在中性或酸性條件下沉淀為結晶尿，損傷腎臟。主要經腎小球濾過而排泄，部分藥物可經腎小管重吸收。有少量從乳汁、膽汁和糞便排出。腎功能障礙時，母體化合物和代謝產物可在體內積累，也可由于腎臟排出緩慢而增強乙?；饔脧亩鴮е露拘栽龃?。

3 檢測方法進展

3.1 儀器分析法

3.1.1 液相色譜分析法

高效液相色譜法是分析磺胺類藥物殘留的國際公認方法，具有選擇性強、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點[10～14]。

何紅梅等[10]采用C18色譜柱（250mm×4.6mm）作固定相，以乙腈（A）及乙腈＋乙酸＋水（20＋1＋79）的混合液（B）按不同比例作流動相進行梯度淋洗使5種磺胺藥物分離，最后在270nm波長處作紫外檢測。方法的測定下限（S/N＝10）為0.04mg/kg，以豬肉樣品為基體加入3種藥物的標準溶液進行回收試驗，測得回收率在73.65%～93.45%之間。

劉海新等[11]建立了鰻魚肌肉中磺胺類藥物殘留的高效液相色譜柱后衍生分析方法。樣品經乙腈和水提取，液－液分配和固相萃取凈化濃縮后，采用高效液相色譜柱后衍生法檢測磺胺類藥物經C18色譜柱分離，在柱后反應單元中與熒光胺反應，生成具有熒光特性的分子，熒光檢測器檢測方法定量檢測限為2.0μg/kg，回收率為85.1%～90.2%，相對標準偏差2.74%～6.04%。

張萍等[12]采用固相萃取－高效液相色譜法同時測定雞蛋粉中12種磺胺類藥物殘留量，樣品用乙腈提取，正己烷脫脂，抽干，鹽酸酸化，過WatersOasisMCX小柱凈化，用甲醇淋洗雜質，6%的氨化甲醇溶液洗脫磺胺類藥物，洗脫液氮氣吹干，流動相溶解后上HPLC儀分析，雞蛋粉中12種磺胺藥物的最小檢出限在0.002～0.045μg/g。

林海丹等[13]研究了動物源性食品中磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹啉藥物殘留的提取、凈化和高效液相色譜分析條件，建立了高效液相色譜法同時測定動物源性食品中磺胺類藥物殘留的方法，該法檢出限為0.010×10－6～0.020×10－6（w），添加回收率為71%～83%。

余輝菊等[14]采用新的樣品前處理方法：基質固相分散萃取技術對牛奶中殘留的磺胺類藥物進行提取和凈化，HPLC法測定。8種磺胺類藥物的回收率在68.3%～101.2%之間，相對標準偏差在2.4%～7.6%之間，該方法樣品前處理簡單、快速，定性定量準確，分析成本低，易于推廣應用。

高效液相色譜檢測方法分析食品中藥物殘留，樣品前處理步驟往往占去整個分析時間的70%～90%，成為制約食品分析速度的瓶頸。而且樣品前處理用大量有機溶劑提取，對人體傷害比較大，分析周期長，所以不適用藥物的快速檢測。

3.1.2 液質聯用分析法

近年來，隨著質譜技術的發(fā)展，聯用技術在磺胺藥物殘留分析中，不但能提供結構信息，而且靈敏度高，選擇性好，特異性強，因此越來越用于磺胺類藥物殘留的確證分析[15～18]。

蔣原等[15]利用高效液相色譜－電噴霧串聯質譜測定了蜂蜜、蜂王漿、鮰魚、鰻魚、豬肉、豬腎、豬肝、雞肉、牛肉和牛奶中的三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧芐氨嘧啶和奧美普林3種磺胺類藥物增效劑。通過實際樣品添加回收實驗，所有基質定量下限為5.0μg/kg，3個添加水平的回收率為63%～89%，相對標準偏差為3.2%～6.9%。

范瑩瑩等[16]建立一種用高效液相色譜與質譜聯用法測定豬肉組織中磺胺類藥物殘留的方法。樣品經2%的醋酸水溶液提取后通過固相萃取柱凈化，用甲醇洗脫，吹干，然后用流動相A溶解，用DAD及MS檢測器檢測。該方法回收率范圍為55.3%～102.8%，相對標準偏差在0.79% ～10.4%之間，方法的最低檢出限為0.1～0.5ppb。

陳瑩等[17]采用超高效液相色譜串聯質譜法對鰻魚中大環(huán)內酯類、喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留量進行測定的同時測定鰻魚組織。采用多反應監(jiān)測模式進行測定，外標法定量，在酸化條件下用乙腈提取，經正己烷除油，檢出限為0.1～0.2μg/kg，回收率60%～97%，相對偏差不大于12.6%，線性回歸相關系數在0.9974～0.9999之間。

吳西梅等[18]用高效液相色譜電噴霧質譜（ESIMSn）測定肉品中的磺胺二甲嘧啶，通過多級質譜對陽性樣品確證。以二級碎片做定量離子，磺銨二甲嘧啶測定線性范圍為25～400μg/L，最低檢出濃度為5μg/L。該方法簡便快速，檢出限低。

液相色譜－串聯質譜儀法測定磺胺類藥物殘留，由于以子離子和母離子定性和定量，能夠假陽性，而且樣品前處理比液相色譜簡單，不需要衍生化，離子碎片特征性強，提供的信息豐富，靈敏度高，檢出限低，能夠達到歐盟和日本等對進口水產品最高殘留量的要求，但是其儀器設備的購置和運行費用較高，成為常規(guī)分析方法尚有待進一步研究。

3.2 免疫分析法

由于近代免疫學和免疫技術的快速發(fā)展，免疫分析法成為近年來迅速發(fā)展起來的一種藥物殘留的檢測方法。免疫分析法是以抗原和抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎，適用于組織中痕量組分的分析，可以用于規(guī)?；暮Y選。目前用于磺胺類藥物殘留檢測的免疫分析法主要放射免疫分析（RIA）和酶聯免疫分析（ELISA）兩種，此類方法不僅靈敏度高、準確性好，同時還具有操作簡單、快速、檢測成本低、適用于大批量樣品檢測的優(yōu)點。

3.2.1 放射免疫分析法

放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）是較早應用的一種免疫分析技術，利用同位素標記的與未標記的抗原同抗體發(fā)生競爭性抑制反應的放射性同位素體外微量分析方法，又稱競爭性飽和分析法。RIA法的優(yōu)點是靈敏、特異、簡便易行、用樣量少等，缺點是有時會出現交叉反應、假陽性反應，組織樣品處理不夠迅速，不能滅活降解酶和鹽及pH有時會影響結果等。傳統(tǒng)的放射免疫分析法檢測磺胺類藥物殘留，檢出限較高，所以應用較少。林杰等[19]人曾應用charm放射免疫分析法測定了商品蝦中磺胺類藥物殘留，并探討了檢測過程中時間因素對樣品檢測數據的影響。

3.2.2 酶聯免疫法

酶聯免疫吸附劑測定法，簡稱酶聯免疫法，它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然后通過顯色來檢測。酶聯免疫試劑盒是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。由于ELISA（酶聯免疫吸附試驗，酶聯免疫試劑盒）具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，得到迅速的發(fā)展和廣泛應用。萬宇平等[20]在常規(guī)酶聯免疫法的基礎上，將磺胺類母核與牛血清白蛋白合成免疫抗原后免疫小鼠制得磺胺類單克隆抗體，并進一步優(yōu)化抗體工作濃度、反應時間等實驗參數，建立了一種簡便、快速、精確的磺胺類殘留一步式化學發(fā)光酶聯免疫檢測方法，與常規(guī)ELISA方法相比，檢測限和靈敏度基本一致，但反應時間縮短了60min，證明采用一步式化學發(fā)光酶聯免疫檢測磺胺類殘留可以大幅度縮減檢測時間，符合快速檢測的要求。

3.2.3 膠體金免疫分析法

膠體金免疫技術（Immune colloidal gold technique）是20世紀80年代發(fā)展起來的一項新的免疫分析方式，是應用膠體金標記技術，以膠體金作為示蹤物，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術，它具有簡便、快速、特異性強、靈敏度高、費用低的優(yōu)點。李奎等[21]人采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，用膠體金標記抗磺胺類藥物母核結構單克隆抗體，磺胺類藥物競爭物包被于硝酸纖維素膜，制成免疫層析快速檢測試紙條，該方法可以在15min內完成對磺胺類藥物的半定量殘留檢測，可作為磺胺類藥物殘留的快速篩選方法。

藥物殘留檢測試劑盒具有簡便迅速、特異性強、靈敏度高、樣品預處理簡單等優(yōu)點，能滿足磺胺類藥物殘留的快速檢測的要求。由于磺胺類藥物是小分子物質，沒有免疫原性，必須連接到大分子載體上產生特異性免疫應答，所以藥物殘留試劑盒在穩(wěn)定性和準確度方面存在一定的局限性，檢測過程中容易出現假陽性，所以限制了其應用。

4 研究展望

磺胺類藥物殘留的檢測從早期的分光光度法、熒光法、到近些年的色譜分析、質譜的分析法、毛細管電泳法和超臨界流體色譜法，幾乎所有的分析理論和技術在SAs殘留分析中都得到了研究和應用，其中采用最多的篩選方法是反相高效液相色譜法（HPLC），后來發(fā)展的酶聯免疫吸附測試方法（EL ISA）作為篩選方法也得到了廣泛的應用。

隨著人們對水產類食品安全問題的日益關注，對獸藥殘留檢測方法的精確度、時效性要求越來越高，人們不斷地探索研究新技術并將其應用于磺胺類藥物殘留的檢測。儀器分析法在藥物殘留方面的檢測會越來越受到重視，液相色譜法具有高靈敏度、低檢出限、準確重復性好的優(yōu)點，在今后一段時間內，還是磺胺類藥物檢測的常用方法。液質聯用法前處理比較簡單，耗時少，靈敏度高，檢出限低，滿足檢測要求，但是成本比較高，儀器價格昂貴，是未來的發(fā)展趨勢。隨著技術的提高，酶聯免疫試劑盒測定藥物殘留能夠大大提高檢測效率和滿足多樣品的同時檢測。隨著方法的不斷改進、材料的不斷更新，其會更為簡便實用，標準化免疫法能夠成為藥物殘留的快速檢測方法。

食品中磺胺類藥物殘留關乎人民群眾的生命健康，僅僅提高檢測技術是不行的，要提高廣大民眾的認識，建立健全法制法規(guī)，廣泛宣傳增強法制觀念，嚴懲觸犯食品安全的企業(yè)和個人，切實提高我國食品安全水平。

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