張從文，李紅梅，2，尤繼明，2，江 浩，2

（1.江蘇省寶應(yīng)縣產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇 寶應(yīng)225800；2.江蘇省寶應(yīng)縣國(guó)家有機(jī)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 寶應(yīng)225800）

1 引言

我國(guó)各種水體富營(yíng)養(yǎng)化十分嚴(yán)重。水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的藍(lán)藻水華，不僅破壞了健康、平衡的水生生態(tài)系統(tǒng)，而且因藻細(xì)胞破裂后釋放出微囊藻毒素（Microcystin，MC）［1～7］、節(jié)球藻毒素（Nodularia）、束絲藻毒素（Aphantoxin）等多種毒素而對(duì)飲用水的安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅［8～12］。

在所有藍(lán)藻毒素中MC是淡水中產(chǎn)生量最大、分布最廣泛和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素類型。微囊藻毒素主要存在于微囊藻（Microcystis）、魚腥藻（Anabaena）、顫藻（Oscillatoria）和念珠藻（Nostoc）中，也有人從眠狀軟管藻（Hapalosiphon hibernicus）中分離到了MC。MC正常情況下存在于藍(lán)藻的細(xì)胞內(nèi)，只有當(dāng)細(xì)胞死亡或破裂后才會(huì)釋放到周圍水體中［8，9］。MC基本結(jié)構(gòu)是由7個(gè)氨基酸組成的單環(huán)多肽，也稱7肽單環(huán)肝毒素，相對(duì)分子量在1000左右，由于多肽可變位置上氨基酸種類的變化，導(dǎo)致了MC的多樣性。目前已發(fā)現(xiàn)了60多種不同類型的MC。MC均含有一種特殊的3－氨基－9－甲氨基－2，6，8－三甲基－10－苯基－4，6－癸二烯酸 （Adda）。在天然水體中發(fā)現(xiàn)最多，檢出頻率最高，毒性較大的是MC－LR、RR和YR（L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸）。

目前，水中微囊藻毒素檢測(cè)方法很多，大致分為三類：①化學(xué)法，包括薄層層析法（TLC），液相色譜法（LC）［13～16］，液質(zhì)聯(lián)用法（HPLC－MS）［17～19］，毛細(xì)管電泳法（CE）等；②生物法，包括生物體法，酶抑制－蛋白磷酸酶PP1／PP2A法；③免疫化學(xué)法，包括放射免疫法（RIA），間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法（idc－ELISA），直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法（dc－ELISA），夾心免疫法（Sandwich－ELISA）。

2 化學(xué)法

2.1 薄層層析法（TLC）

薄層層析法是將固定相（如硅膠）薄薄地均勻涂敷在底板（或棒）上，試樣點(diǎn)在薄層一端，在展開罐內(nèi)展開，由于各組分在薄層上的移動(dòng)距離不同，形成互相分離的斑點(diǎn)，測(cè)定各斑點(diǎn)的位置及其密度就可以完成對(duì)試樣的定性、定量分析的色譜法。

2.2 液相色譜法（LC）

高效液相色譜具有高壓、高速、高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣，更適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于各種分析檢測(cè)中。吳偉文［13］等采用固相微萃取與高效液相色譜法聯(lián)用技術(shù)分析了水溶液中痕量的微囊藻毒素，該方法測(cè)定MC－LR（LR型微囊藻毒素）的線性范圍為1.00～200μg／L，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，檢出限為0.45μg／L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.4%，回收率為90%～99%。該方法測(cè)定MC－RR（RR型微囊藻毒素）的線性范圍為1.00～100μg／L，相 關(guān)系數(shù)為 0.9988，檢 出限為 0.15μg／L，RSD為2.4%，回收率為89%～100%。

郭堅(jiān)［14］等建立了一種全自動(dòng)化在線固相萃?。咝б合嗌V法快速、準(zhǔn)確測(cè)定水體中3種痕量微囊藻毒素的新方法。樣品用自動(dòng)進(jìn)樣器連續(xù)注入固相萃取小柱完成富集后，通過雙梯度高效液相系統(tǒng)中的一個(gè)泵（上樣泵）實(shí)現(xiàn)凈化，再通過閥切換將固相萃取小柱切換至分析流路中，用另一個(gè)泵（分析泵）將待測(cè)物沖洗至分析柱進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)波長(zhǎng)為238nm，進(jìn)樣體積為10mL，整個(gè)分析時(shí)間為20min。方法在0.5～10μg／L范圍線性良好，3種微囊藻毒素的線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.9996，檢出限為0.1μg／L（S／N＞3），6次平行測(cè)定峰面積RSD＜1.6%，方法可有效應(yīng)用于水體中痕量微囊藻毒素的測(cè)定。

戚莉莉［15］等建立了有效準(zhǔn)確的檢測(cè)方法：流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)：35%乙腈＋65%水；體積流量：0.8～1.0 mL／min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)239nm；進(jìn)樣量10μL；在該條件下，以HPLC測(cè)定MC的檢測(cè)限值為0.1mg／L。并應(yīng)用該法分析了2007年太湖藍(lán)藻爆發(fā)期間的水樣，結(jié)果表明方法具有實(shí)用性。

張立將［16］等選用甲醇－0.05%三氟乙酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)MC－RR和MC－LR取得較好分離效果，水樣檢出限可達(dá)0.02μg／L。優(yōu)化后的前處理、檢測(cè)方法，對(duì) MC－RR，MC－LR平均回收率分別為88.9%，并且優(yōu)化了前處理方法－冰乙酸處理法。

2.3 液質(zhì)聯(lián)用法（HPLC－MS）

液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

王蕾［17］等以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)銅綠微囊藻為原料，建立了固相萃取富集微囊藻毒素，液相色譜－電噴霧電離質(zhì)譜測(cè)定藻樣中的微囊藻毒素 MC－LR的方法。該法絕對(duì)檢出限為25pg，回收率為70%以上，方法靈敏度高，實(shí)用性強(qiáng)。

王超［18］等利用固相萃取富集和凈化，經(jīng)LC分離后，采用DAD和IT MS定性分析，DAD定量分析。在優(yōu)化的條件下，水中5種微囊藻毒素的檢出限為0.1μg／L；3個(gè)質(zhì)量濃度加標(biāo)水平（0.2、0.8和5μg／L）的平均回收率為52.2%～115.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～10.0%。

虞銳鵬［19］等通過固相萃取富集微囊藻毒素，并采用液相色譜－電噴霧電離質(zhì)譜測(cè)定水中的微囊藻毒素－RR，－LR。分別在 m／z為520.4、996.3時(shí)，采用選擇離子掃描方式，提高檢測(cè)靈敏度。該法檢出限為0.01μg／L；線性定量范圍為0.02～20μg／L。該方法靈敏度高，實(shí)用性強(qiáng)，可為水質(zhì)藻毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)水處理脫毒效能，提供靈敏、準(zhǔn)確的分析方法。

化學(xué)分析法不僅能定量精確的檢測(cè) MCs，可對(duì)不同的MC作精確定性定量測(cè)定，運(yùn)用恰當(dāng)可測(cè)到各組分的μg／L級(jí)的含量。但是由于化學(xué)分析方法需要復(fù)雜的前處理過程，并且所需的儀器價(jià)格昂貴，限制了它的實(shí)際應(yīng)用。近年來，隨著新的萃取技術(shù)的出現(xiàn)，固相微萃取技術(shù)（SPME）、基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)（MSPDE）和免疫吸附萃取技術(shù)（IE）等也應(yīng)用于MCs檢測(cè)的前處理中。這些技術(shù)高效、快速、節(jié)省時(shí)間，耗費(fèi)有機(jī)溶劑極少甚至不用溶劑，提高了樣品中MCs的提取率，保證了檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

3 生物法

生物分析法用動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)間接推算MC的含量，結(jié)果較為直觀、快速，但無法用于準(zhǔn)確定量測(cè)定。蛋白磷酸酶法利用MC能夠抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A活性的特點(diǎn)，以磷酸化蛋白為底物，測(cè)定MCs對(duì)蛋白磷酸化酶的抑制程度，即測(cè)定MCs、磷酸化蛋白、蛋白磷酸化酶反應(yīng)后釋放的磷酸鹽的量來檢測(cè)微囊藻毒素的量。蛋白磷酸酶法可以反映各種毒素的總量、檢測(cè)靈敏度高而且測(cè)定時(shí)間較短，在用于環(huán)境監(jiān)測(cè)時(shí)具有優(yōu)勢(shì)。但蛋白磷酸酶法的檢測(cè)限度是pg級(jí)，低于WHO標(biāo)準(zhǔn)，酶反應(yīng)體系中的很多變量尚未進(jìn)行量化和建立一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，方法選擇性較差，對(duì)于各種MCs的靈敏度不同，只能測(cè)定毒素總量，無法分別測(cè)定不同種類毒素的量，也不能夠區(qū)分微囊藻毒素和其他的蛋白磷酸酶抑制劑，測(cè)定的是MCs的總量，如果藍(lán)藻本身具有內(nèi)源蛋白磷酸酶活性，則有可能使PP1的結(jié)果偏低。此外，蛋白磷酸酶價(jià)格很昂貴，若自己制備則對(duì)設(shè)備和操作人員的要求非常高［20］。

4 免疫化學(xué)法

免疫檢測(cè)方法的原理是利用微囊藻毒素誘發(fā)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，利用抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別來對(duì)各種毒素進(jìn)行檢測(cè)。樣品處理簡(jiǎn)單，便于操作，被國(guó)內(nèi)外同行廣泛接受。近年來，免疫檢測(cè)方法已發(fā)展出多種單克隆抗體和多克隆抗體，用這兩種抗體制成的MCs酶聯(lián)免疫測(cè)試試劑盒已商品化。但是由于這些試劑盒所用抗體一般是針對(duì)MC－LR設(shè)計(jì)，使得它對(duì)于MCs其他異構(gòu)體交叉反應(yīng)性低，因此試劑盒對(duì)于許多天然存在的MCs靈敏度差異較大，不能檢測(cè)所有的毒素。而且酶聯(lián)免疫法假陽性出現(xiàn)幾率大，重現(xiàn)性差［21］。

5 問題與展望

在所有分析微囊藻毒素的檢測(cè)方法中色譜法結(jié)果穩(wěn)定可靠，操作簡(jiǎn)單，是目前應(yīng)用最多的方法，有廣闊地發(fā)展前景。但是如何檢測(cè)毒素國(guó)家尚未有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法，而且，天然水體中通常微囊藻毒素的濃度較低，因此，研究和發(fā)展低濃度藻毒素的分析鑒定方法以對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)十分重要。

通過研究不同介質(zhì)中痕量MC的提取、富集方法，優(yōu)化樣品的前處理過程，利用高效、高靈敏的聯(lián)用技術(shù)和多殘留組分確證技術(shù)分析MC－RR、LR和YR，并且在此基礎(chǔ)上努力研究發(fā)展一些簡(jiǎn)單、快速和便攜化的篩選多殘留分析技術(shù)將有助于水源受富營(yíng)養(yǎng)化污染的城市之供水部門發(fā)展新的水質(zhì)監(jiān)測(cè)分析技術(shù)，控制供水水質(zhì)，保障人民的安全與健康。

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