姚小飛，吳曉慧，葉 璐

（1．武漢生物工程學(xué)院生物工程系，湖北 武漢430415；2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢430205；3．武漢市漢鐵高級中學(xué)，湖北 武漢430010）

目前，發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)酒精的菌種主要以酵母菌為主。酒精是酵母菌厭氧發(fā)酵的重要產(chǎn)物，而過多的酒精對酵母菌細胞本身具有毒害作用，會影響細胞膜成分和細胞代謝。因此，酵母菌的產(chǎn)酒精能力與耐酒精能力是密不可分的。Thomas直接以抑制菌株生長時的酒精濃度來表達該菌株的酒精耐受性，并根據(jù)不同酒精濃度耐受性將菌株分為3個等級［1］。我國測定酵母菌耐受酒精濃度的方法基本屬于此種范疇［2，3］。

作者結(jié)合酵母菌產(chǎn)酒精能力的檢測，利用鑒別性平板技術(shù)更快速地選育優(yōu)良的高酒精耐受性產(chǎn)酒酵母菌，具有生產(chǎn)實踐意義。

1 實驗

1．1 樣品來源

采集某高粱釀酒廠的大曲酒糟作為實驗樣品。

1．2 培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL，pH值自然。

YPD固體培養(yǎng)基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、瓊脂2%、蒸餾水，pH值自然。

TTC上層培養(yǎng)基［4］：葡萄糖5g，瓊脂15g，TTC 0．5g，蒸餾水1000mL。

TTC下層培養(yǎng)基：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母膏1．5g，磷酸二氫鉀1．0g，硫酸鎂0．4g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 值5．5～5．7。

1．3 方法

1．3．1 產(chǎn)酒酵母菌的分離

取適量樣品置于PDA液體培養(yǎng)基（添加12%酒精）中，于28℃下富集培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)液進行梯度稀釋。分別取10－5、10－6、10－7稀釋度的菌懸液各0．1 mL涂布于TTC下層培養(yǎng)基上，于28℃下恒溫培養(yǎng)24h后，在其上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基，于28℃保溫培養(yǎng)3h，觀察顯色反應(yīng)。根據(jù)顏色現(xiàn)象選取產(chǎn)酒精能力強的菌株進一步劃線純培養(yǎng)［5］。

1．3．2 產(chǎn)酒酵母菌的酒精發(fā)酵能力檢測

采用二氧化碳失重法［6，7］測定酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)酒精能力。利用酒精計測定酵母菌發(fā)酵的酒精含量。

1．3．3 產(chǎn)酒酵母菌酒精耐受能力檢測

向已經(jīng)滅菌的YPD固體培養(yǎng)基中加入不同體積的無水酒精，調(diào)整體積分數(shù)分別為12%、14%、16%、18%、19%、20%，將初篩的菌株分別接種至不同酒精體積分數(shù)的平板上，標(biāo)記靜置10min后，于28℃下恒溫培養(yǎng)48h。

1．3．4 酵母菌的鑒定

用美藍對酵母菌進行染色，觀察酵母菌個體形態(tài)。用測微尺測定酵母菌的大小。觀察酵母菌群體在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征。

分別對篩選得到的酵母菌進行氮源同化試驗［8，9］、糖發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗、脂肪水解試驗、尿素酶試驗、重氮基藍B（DBB）試驗，對酵母菌進行鑒定。

1．3．5 酵母菌的紫外誘變

參照文獻［10］方法進行酵母菌生長曲線的繪制。

分別取生長期的菌液3mL加至9套平皿中，攪拌均勻，在254nm波長下，分別經(jīng)紫外線照射（垂直距離30cm）10s、20s、30s、40s、80s、120s、160s、200s、240s后，取出1mL處理菌液稀釋至10－2，取0．1mL涂于平板上，包扎后置于暗處28℃培養(yǎng)48h。以照射時間為橫坐標(biāo)、致死率為縱坐標(biāo)繪制酵母菌的生長曲線。

采用致死率為60%～80%的條件進行誘變操作，將誘變后的菌液涂布于含20%、21%、22%酒精的YPD固體培養(yǎng)基平板上，于28℃下恒溫培養(yǎng)48～72 h后觀察。

2 結(jié)果與討論

2．1 產(chǎn)酒酵母菌的分離

培養(yǎng)液涂布于TTC顯色平板后，共篩選出26株具有不同產(chǎn)酒精能力的酵母菌。其中12株呈深紅色、9株呈微紅色、5株呈粉紅色，分別編號后進一步劃線分離。

2．2 產(chǎn)酒酵母菌的酒精發(fā)酵能力和酒精耐受能力檢測

對初篩得到的12株呈深紅色的酵母菌菌株分別進行酒精發(fā)酵實驗，結(jié)果如表1所示。

表1 初篩菌株的酒精發(fā)酵能力Tab．1 The fermentation ability of the preliminarily－screened strains

由表1可以看出，S5、S9、S13、S15、S16、S17、S24等7株酵母菌的產(chǎn)酒精能力較強，檢測這7株酵母菌的酒精耐受能力，結(jié)果見表2。

表2 7株酵母菌的酒精耐受性Tab．2 Alcohol tolerance of the seven yeast strains

由表2可知，隨著酒精體積分數(shù)的增大，酵母菌的生長逐漸受到抑制。比較7株菌株，其中僅有菌株S17可以耐受19%的酒精。因此，將菌株S17作為后續(xù)實驗的目標(biāo)菌株。

2．3 菌株S17的鑒定

2．3．1 形態(tài)大小觀察

菌株S17的個體形態(tài)見圖1，菌落形態(tài)見圖2。

由圖1可知，S17營養(yǎng)細胞呈圓形或橢圓形，繁殖方式主要為芽殖，細胞大小為（2．1～3．5）μm×（7．1～13）μm。

由圖2a可知，菌株S17的菌落為圓形，大小為4．0～5．5mm，邊緣整齊，有明顯的凸起，菌落呈乳白色，透明度較差，質(zhì)地光滑較濕潤。圖2b為TTC顯色平板上的劃線分離結(jié)果。

2．3．2 生理生化試驗

菌株S17的氮源同化及糖發(fā)酵試驗結(jié)果分別見表3、表4，其它生化試驗結(jié)果見表5。

表3 菌株S17對氮源的同化情況Tab．3 The nitrogen assimilation for strain S17

表4 菌株S17對糖類的發(fā)酵情況Tab．4The carbohydrate fermentation for strain S17

表5 菌株S17的其它生理生化指標(biāo)Tab．5 The physiological and biochemical characters identification of strain S17

綜合上述形態(tài)觀察和生理生化試驗結(jié)果，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》，初步確定S17屬于酒香酵母屬（Brettanomyces）。

2．4 菌株S17的紫外誘變

2．4．1 菌株S17的生長曲線

以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株S17的生長曲線，結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌株S17的生長曲線Fig．3 The growth curve of strain S17

由圖3可知，菌株S17培養(yǎng)至18～20h即到達穩(wěn)定期。因此，選擇培養(yǎng)20h的酵母菌細胞作為最佳出發(fā)菌種。

2．4．2 菌株S17的致死曲線

經(jīng)平板菌落計數(shù)，計算出紫外線照射不同時間的致死率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株S17的致死曲線Fig．4 The mortality curve of strain S17

由圖4可知，隨著紫外線照射時間的延長，菌株S17的致死率呈上升的趨勢。照射時間為120s時，致死率就達到了82%；照射時間為160s時，致死率達到90%。因此，選擇最佳紫外線照射時間為120s。

2．4．3 正突變株的篩選

將生長期酵母菌懸液經(jīng)紫外線照射120s后，適當(dāng)稀釋涂布于含20%、21%、22%酒精的YPD固體培養(yǎng)基平板上進行篩選，結(jié)果在含20%酒精的平板上篩選出一株正突變株，標(biāo)記為酵母菌S－T－01。

3 結(jié)論

從某高粱釀酒廠的酒糟中，通過TTC平板顯色實驗，共篩選到26株具有產(chǎn)酒精能力酵母菌。對26株酵母菌分別進行酒精發(fā)酵能力和酒精耐受能力檢測，最終獲得一株耐受19%酒精的酵母菌株，編號為S17。對菌株S17進行形態(tài)觀察及生理生化試驗，鑒定菌株S17屬于酒香酵母屬（Brettanomyces）。對菌株S17進行紫外誘變以提升其耐酒精的能力。結(jié)果表明，菌株S17經(jīng)紫外線照射120s，篩選到一株可以耐受20%酒精的正突變株，相比原始菌株的酒精耐受力提高了1%。

［1］蘇艷秋，朱衛(wèi)華，吳鵬，等．耐高溫、耐高酸產(chǎn)酒精酵母的篩選與鑒定［J］．微生物學(xué)雜志，2009，29（2）：43－47．

［2］李艾，郝玉翠，郝斌．耐高溫高產(chǎn)酒精酵母的篩選及生理特性的初步研究［J］．唐山學(xué)院學(xué)報，2009，22（3）：74－76．

［3］寇運同，胡勇松，王忠彥，等．高產(chǎn)酒精酵母SP－48的基本生理特性研究［J］．釀酒，2004，31（2）：22－25．

［4］秦人偉，周悅．耐高酒精酵母菌株的選育［J］．釀酒科技，1994，（6）：22－24．

［5］秦成國．玉米粉高濃度酒精發(fā)酵的研究［J］．釀酒科技，1997，（4）：52－54．

［6］王濱，張國紅．濃醪酒精發(fā)酵酵母菌的選育［J］．天津輕工學(xué)院學(xué)報，2001，9（3）：33－36．

［7］張學(xué)群，張柏青．啤酒工藝控制指標(biāo)及檢測手冊［M］．北京：中國輕工業(yè)出版社，1993：385－386．

［8］楊汝德．現(xiàn)代工業(yè)微生物學(xué)教程［M］．北京：高等教育出版社，2010：9－13．

［9］Bamett J A．酵母菌的特征與鑒定手冊［M］．青島：中國海洋大學(xué)出版社，1991：168．

［10］李用芳，李學(xué)梅．面包酵母原生質(zhì)體的制備，再生及紫外線誘變的初步研究［J］．生物技術(shù)，2000，10（2）：23－26．