于巧玲，李建平

(1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.柳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與食品工程系，廣西 柳州 545006)

蛋白質(zhì)是維持生命活動(dòng)的重要物質(zhì)。血清中白蛋白濃度的降低是低蛋白血癥和營(yíng)養(yǎng)失調(diào)的典型癥狀；血清或尿液中的白蛋白濃度變化與 慢性肝功能障礙、糖尿病性腎病息息相關(guān)，也是胰島素依賴型糖尿病的可能誘因[1]。最新研究表明，糞便中血紅蛋白和白蛋白可以用于非侵入式篩查大腸癌[2]。因此，血清白蛋白的檢測(cè)對(duì)于生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)都有重要意義。白蛋白的檢測(cè)尚未有全球化的標(biāo)準(zhǔn)方法，電化學(xué)傳感器具有高靈敏度、低檢出限的優(yōu)點(diǎn)[3]，是常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。然而，作為核心部件的修飾電極在電化學(xué)分析的過程中，締合、雜交等反應(yīng)通常在電極表面發(fā)生，使得電極表面更新困難，重復(fù)使用使得測(cè)定的精密度和重現(xiàn)性變差，而整個(gè)電極的重復(fù)制作又不經(jīng)濟(jì)。因此，制作能多次使用的修飾電極是電化學(xué)分析的重要研究?jī)?nèi)容。

磁性納米粒子可以在非接觸性的磁力作用下，與其它物體結(jié)合；磁力消失后又瞬間分離，具有更新方便的特點(diǎn)，是理想的可更新修飾電極原料。本文將磁性納米粒子結(jié)合在電化學(xué)性能和吸附性能優(yōu)良的碳納米管（CNTs）上，制成了更新方便、實(shí)用的磁性碳納米管修飾電極，成功實(shí)現(xiàn)了皮克級(jí)牛白蛋白（BA）的測(cè)定，檢出限為1.2pg·mL-1。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日本島津H600 型透射電鏡；CHI 66 0B 電化學(xué)工作站，使用三電極體系，即參比電極為飽和Ag/AgCl 電極，對(duì)電極為鉑絲電極，工作電極為自制的磁性CNTs 修飾電極。

BA，配好的水溶液在4℃的冰箱內(nèi)保存，2d 內(nèi)使用；CNTs，多壁碳納米管，外徑10nm，純度＞95%；其余無機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 磁性CNTs 的制備與負(fù)載

本文參考了文獻(xiàn)[4]中有關(guān)磁性納米粒子的合成，并做了適當(dāng)調(diào)整使磁性納米粒子Fe3O4牢固結(jié)合在CNTs 上。具體實(shí)驗(yàn)方法為：稱取1g CNTs 置入25mL 的FeCl3（0.5mol·L-1）溶液中，超聲60min；在攪拌條件下，分別滴入14.3mL FeSO4（0.5mol·L-1）和3.5mL 濃氨水,攪拌15min 后,繼續(xù)緩慢滴入1.5mL 濃氨水,繼續(xù)攪拌30min 后，置于80℃恒溫水浴中反應(yīng)30min。然后將合成的磁性CNTs 在磁力的約束下反復(fù)沖洗至中性、干燥，制成了磁性CNTs 納米粒子。

取0.2g 制備好的磁性CNTs，置于0.5mmol·L-1ARS 水溶液中震蕩吸附8h。反復(fù)沖洗后轉(zhuǎn)移至25mL 容量瓶中，定容，得到負(fù)載ARS 的磁性CNTs的懸濁液。

1.3 磁性CNTs 修飾電極的制做

在玻璃管內(nèi)依次封裝玻碳片、彈簧，鐵棒；為了保證良好的導(dǎo)電性，石墨糊填充在鐵棒與玻碳之間；電極尾端用塑料圓片粘膠密封，就制成了玻碳裸電極。對(duì)該電極進(jìn)行物理性拋光，然后依次置于（1∶1）HNO3、無水乙醇中超聲清洗5min，沖洗干燥后，將5μL 負(fù)載ARS 的磁性CNTs 納米粒子懸濁液滴到玻碳裸電極上，在永久性白磁鐵的作用下，這些納米就牢牢附著在玻碳裸電極上制成磁性CNTs 修飾電極，即得工作電極(圖1)。

圖1 碳納米管磁性修飾電極示意圖

1.4 測(cè)定方法

在10mL 容量瓶中加入0.7mL H2SO4（0.2mol·L-1），一定量的BA 標(biāo)準(zhǔn)溶液,用0.2 mol·L-1的KCl 定容，然后全部轉(zhuǎn)移至燒杯中，靜置100s，使BA 與電極表面的ARS 反應(yīng)。在-0.1～-0.45V 間，掃描速度為0.1V·s-1條件下，記錄穩(wěn)定后的循環(huán)伏安曲線,測(cè)量前后電流變化值。磁性修飾電極每次使用后，棄去磁性CNTs納米粒子，拋光清洗玻碳裸電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性CNTs 納米粒子的表征

磁性CNTs 納米粒子形貌采用日本島津H600型透射電鏡進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2 所示?？梢钥闯?，CNTs 上沉積有較多的球形Fe3O4納米粒子，這些磁性粒子結(jié)合在CNTs 的外壁上，粒徑分布集中在15～25nm 之間，其尺寸與形狀與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。顯然，采用本文上述的實(shí)驗(yàn)方法，可以在CNTs 外表面結(jié)合具有磁性的Fe3O4納米粒子，從而實(shí)現(xiàn)磁性CNTs 納米粒子的制備。

圖2 磁性CNTs 納米粒子的透射電鏡圖

2.2 磁性CNTs 修飾電極的伏安特性

考察了磁性CNTs 修飾電極在0.14mol·L-1H2SO4-0.2mol·L-1KCl 介質(zhì)以及加有BA 溶液中的循環(huán)伏安特性，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，玻碳裸電極背景低，沒有任何氧化還原峰（圖3c）；修飾成磁性CNTs 修飾電極后，修飾電極中的ABS 直接發(fā)生氧化還原反應(yīng)，形成明顯的氧化還原電流（圖3a），說明該磁性CNTs 修飾電極電子傳導(dǎo)性能良好，ARS的峰形稍差主要是由于ARS分子內(nèi)大π鍵中的π-π電子與CNTs 內(nèi)碳原子的sp2雜化形成的六元環(huán)相互重疊成鍵，影響到電化學(xué)氧化還原過程，使得ARS峰形變差；隨著BA 的加入，BA 逐步與ARS 反應(yīng)，ARS 的峰電流變小、峰形卻逐漸變好（圖3b）。BA由3個(gè)圓筒狀的包埋有疏水性氨基酸殘基的疏水性空腔[5]組成，電極反應(yīng)時(shí)，ARS 分子嵌入BA 疏水性空腔形成非電活性的超分子化合物導(dǎo)致峰電流變小，同時(shí)ARS 也遠(yuǎn)離碳元素的π 電子，峰形變好。圖3 充分說明磁性CNTs 修飾電極具有良好的電化學(xué)性能，對(duì)BA 響應(yīng)明顯，適合BA 測(cè)試使用。

圖3 循環(huán)伏安圖

2.3 測(cè)試底液的優(yōu)化選擇

分別以硼砂緩沖液、Tris-HCl、NH3.H2O-NH4Cl、HAc-NaAc、磷酸鹽緩沖液、鹽酸、硫酸等溶液作為底液進(jìn)行pH 的優(yōu)化選擇。結(jié)果表明，在硫酸介質(zhì)中ARS 循環(huán)伏安圖的峰形最好，峰電流最大。改變硫酸溶液的pH 進(jìn)一步考察，當(dāng)pH ≤2 時(shí)，ARS氧化和還原過程都能得到良好的峰形，主要是因?yàn)榇藭r(shí)的ARS 以分子內(nèi)氫鍵的形式存在[6]；當(dāng)pH ＞2 時(shí)，峰形開始變差，這可能是由于此pH 條件下的ARS 是以一級(jí)電離和二級(jí)電離結(jié)構(gòu)存在,電活性差的原因引起的。因此本文選取0.14mol·L-1硫酸-0.2mol·L-1KCl 作為底液。

2.4 峰電流與掃速的關(guān)系

在BA 溶液中，將負(fù)載ARS 的磁性CNTs 修飾電極以不同掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，結(jié)果見圖4。由圖4 可見，循環(huán)伏安圖峰型很好，是一個(gè)可逆的電化學(xué)過程，并且陰陽(yáng)兩極的峰電流都與掃速v成正比，說明整個(gè)電極過程受吸附控制，而CNTs 的吸附性能優(yōu)良，有利于降低測(cè)定的檢出限。

圖4 掃速對(duì)峰電流的影響

2.5 磁性CNTs 修飾電極對(duì)BA 的測(cè)定

磁性CNTs 修飾電極在掃速為0.1V·s-1，E=-0.45V 條件下對(duì)BA 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，BA 的濃度與峰電流成反比，隨著BA 濃度的增大，峰電流逐漸變小，當(dāng)濃度大于150pg 后，峰電流值出現(xiàn)平臺(tái)，與BA 濃度不相關(guān)。線性回歸方程 為i（mA）＝-36.25C（pg·mL-1）+0.78262,相關(guān)系數(shù)r=0.9994，檢出限為1.2pg·mL-1，線性范圍為4～150pg·mL-1?？梢娫摯判訡NTs 修飾電極對(duì)BA 的測(cè)定靈敏度高、檢出限低。

2.6 電極反應(yīng)速率常數(shù)的測(cè)定

依據(jù)Laviron 理論[7],還原峰電位遵循以下關(guān)系式:

其中,Ep為還原峰電位，單位為V；E0為電極反應(yīng)的克式電位，單位為V；k0為電極反應(yīng)速率常數(shù)，單位為s-1；α 為電子轉(zhuǎn)移系數(shù)；n為反應(yīng)電子數(shù)；F 為法拉第常數(shù),單位為C·mol-1；R 為氣體常數(shù)，以J·mol-1·K-1為單位；T為絕對(duì)溫度，K；v為掃描速度，V·s-1。

由式1 可知,還原峰電位Ep與lnv有線性關(guān)系(圖5)。作Ep和v關(guān)系圖（圖6）,E0由Ep外推在y 軸上的截距求出，E0=-0.2742 V。由圖5 中斜率=-0.0664 可以算出α=0.19,從截距為-0.3526可以求出k0=4.6s-1。

圖5 還原峰電位與掃速對(duì)數(shù)的關(guān)系圖

圖6 還原峰電位與掃速的關(guān)系圖

3 結(jié)論

在CNTs 上合成納米級(jí)Fe3O4，吸附ARS 后，吸到玻碳裸電極表面制成了更新方便的磁性CNTs 修飾電極，成功實(shí)現(xiàn)了皮克級(jí)BA 的測(cè)定。CNTs 吸附性能超強(qiáng)使得檢出限降低，磁性顆粒更新方便。二者的結(jié)合，使得測(cè)定方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，檢出限低，更新方便，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

[1]Monte W C，Johnston C S，Roll L E.Bovine serum albumin detected in infant formula is possible trigger for insulindependent diabetes mellitus[J].J Am Diet Assoc，1994,94（3）：314-316.

[2]Tarpay A，Nemeth M S，Orosz E，et al.A double immunochemical method for detecting faecal haemoglobin and albumin in rectal screening[J].Magyar onkologia，2011,55（4）：268-273.

[3]Rusling J F.Nanomaterials-based electrochemical immunosensors for proteins[J].Chem Rec，2012,12（1）：164-176.

[4]于巧玲，李建平.負(fù)載茜素紅S 的納米磁性碳粉修飾電極測(cè)定牛白蛋白[J].分析化學(xué)，2006，34（2）：247-250.

[5]高道江，王建華.超微磁性Fe3O4粒子的制備[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1997，20（6）：94-97.

[6]朱永春，董紹俊.光譜電化學(xué)方法研究—茜素紅S 在玻碳電極上的電化學(xué)行為[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，1990，48（6）：534-539.

[7]Laviron E.General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems[J].J Electroanal Chem and Interfacial Electrochemistry，1979,101（1）：19-28.