曹娟娟，和七一，趙瑛，張榮春，魏世蓉，鄒家麗，鄧可宣 ，余曉東

（重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／重慶市生物活性物質(zhì)工程研究中心／重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 400047）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病理基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)滑膜炎，公認(rèn)的RA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCS）介導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?；罨?］。因臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，加上類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）特異性較差，在其他自身免疫性疾病甚至正常人血清中都檢測得到，最終因不能及時(shí)治療而致關(guān)節(jié)功能障礙，致殘率較高，嚴(yán)重危害了人類的身體健康［2－4］。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為毒蛇及其毒性成分有祛風(fēng)解毒、鎮(zhèn)痙止痛的功效，能治療風(fēng)濕痛、四肢麻木、半身不遂等癥［5］。本實(shí)驗(yàn)室研制開發(fā)的蛇肽保健酒，肽濃度18mg／100mL，乙醇濃度為35%，具有提高機(jī)體免疫能力、增強(qiáng)機(jī)體性功能、延緩衰老和抗疲勞等功效［6］。佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjunctive arthritis，AA）小鼠是目前廣泛應(yīng)用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型之一。該模型以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征，原發(fā)病變主要是局部急性炎癥反應(yīng)，并于致炎后一段時(shí)間出現(xiàn)繼發(fā)病變，同時(shí)出現(xiàn)以細(xì)胞免疫變化為主的免疫功能紊亂［7］。本研究以AA小鼠為模型，研究蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠足趾和踝關(guān)節(jié)腫脹度、體質(zhì)量、脾臟指數(shù)以及血清循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種健康雄性成年小鼠60只，體質(zhì)量（20±2）g；蛇肽保健酒，酒基，弗氏完全佐劑（FCA），地塞米松片，硼酸緩沖液，聚乙二醇；濃縮儀，電子游標(biāo)卡尺，電子分析天平，酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方式 將60只小鼠隨機(jī)分為6組，即對(duì)照組、模型組、酒基組、蛇肽低劑量組和高劑量組、陽性對(duì)照組，每組10只。除對(duì)照組注射生理鹽水外，在其他各組小鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（FCA）0.02mL誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。造模成功后第2天至34d，開始對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，每只小鼠每天1次，每次0.2mL。陽性對(duì)照組以1mg／kg地塞米松進(jìn)行灌胃，酒基組按10mL／kg灌胃，蛇肽保健酒組分別按8.3mL／kg（低劑量）、33.2mL／kg（高劑量）灌胃，對(duì)照組和模型組用純凈水對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃。

1.2.2 AA小鼠足趾和踝關(guān)節(jié)腫脹度的測定 在造模后第2、10、18、26、34天用電子游標(biāo)卡尺測定各組小鼠右后肢足趾和踝關(guān)節(jié)直徑。

1.2.3 小鼠體質(zhì)量和脾臟指數(shù)的測定 在造模后第2、10、18、26、34天分別稱量小鼠體質(zhì)量。于末次給藥24h后，稱量體質(zhì)量。之后脫頸處死小鼠，剖解剝離脾臟，稱取脾臟質(zhì)量，以脾臟質(zhì)量比小鼠的質(zhì)量作為脾臟指數(shù)。

1.2.4 CIC的測定 造模后第34天，小鼠眼球取血，離心（3000r／min，10min）分離血清，血清用2倍體積0.1mol／L硼酸緩沖液（pH＝8.4）稀釋備用。測定管與對(duì)照管各加稀釋血清30μL，測定管加入4.1%聚乙二醇溶液300μL，對(duì)照管加入上述硼酸緩沖液300μL，混勻后4℃放置1h。用酶標(biāo)儀以495nm波長測定各管吸光度（A）值，檢測結(jié)果表示為測定管A495nm－對(duì)照管A495nm。

表1 蛇肽酒對(duì)AA小鼠右后足趾腫脹度的影響（mm，，n＝10）

表1 蛇肽酒對(duì)AA小鼠右后足趾腫脹度的影響（mm，，n＝10）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.01，與對(duì)照組比較。

組別 第1天 第2天 第10天 第18天 第26天 第34天對(duì)照組 2.29±0.02 2.29±0.02 2.16±0.04 2.36±0.04 2.44±0.07 2.45±0.01模型組 2.33±0.02 3.65±0.17c 3.33±0.10c 3.77±0.07c 3.60±0.24c 3.54±0.08c酒基組 2.32±0.04 3.67±0.14c 3.27±0.10c 3.64±0.06c 3.42±0.11c 3.43±0.07c蛇肽低劑量組 2.30±0.06 3.50±0.07c 3.28±0.07c 3.63±0.09c 3.12±0.09bc 2.92±0.06bc蛇肽高劑量組 2.30±0.06 3.62±0.14c 3.16±0.08c 3.77±0.06c 3.43±0.10c 3.35±0.10c陽性對(duì)照組 2.29±0.09 3.76±0.07c 3.14±0.09c 3.40±0.18ac 3.09±0.15ac 3.18±0.08ac

表2 蛇肽酒對(duì)AA小鼠右后踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響（mm，，n＝10）

表2 蛇肽酒對(duì)AA小鼠右后踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響（mm，，n＝10）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.01，與對(duì)照組比較。

組別 第1天 第2天 第10天 第18天 第26天 第34天對(duì)照組 3.41±0.09 3.35±0.10 3.26±0.03 3.51±0.08 3.35±0.02 3.29±0.08模型組 3.35±0.04 4.24±0.10c 4.12±0.12c 4.43±0.09c 4.21±0.10c 4.25±0.07c酒基組 3.52±0.05 4.31±0.08c 3.95±0.10c 4.38±0.09c 3.92±0.09a 3.88±0.10b蛇肽低劑量組 3.43±0.07 4.32±0.07c 4.04±0.07c 4.43±0.10c 3.97±0.06a 3.82±0.08b蛇肽高劑量組 3.51±0.05 4.26±0.03c 3.90±0.06c 4.32±0.06c 4.02±0.06a 4.00±0.07a陽性對(duì)照組 3.50±0.05 4.40±0.05c 3.96±0.11c 4.07±0.11a 3.93±0.03a 3.90±0.12a

表3 蛇肽酒對(duì)AA小鼠體重的影響（g，，n＝10）

表3 蛇肽酒對(duì)AA小鼠體重的影響（g，，n＝10）

a：P＜0.05，與陽性對(duì)照組比較。

組別 第1天 第2天 第10天 第18天 第26天 第34天對(duì)照組 18.92±0.59 20.79±0.63 27.93±1.16 32.98±0.97 36.55±1.18 37.62±1.20模型組 19.00±0.30 20.43±0.43 27.34±0.73 32.44±1.71 34.74±2.04 35.93±2.31酒基組 20.08±0.35 21.40±0.31 26.22±0.88 31.99±1.36 35.56±1.21 36.81±1.11蛇肽低劑量組 19.50±0.70 20.86±0.39 26.74±1.27 34.21±1.56 38.16±1.61a 39.80±1.83a蛇肽高劑量組 19.33±0.49 20.82±0.47 25.82±1.04 32.50±0.97 36.27±1.04 37.68±1.38陽性對(duì)照組 19.42±0.47 21.00±0.56 26.23±0.99 28.95±1.93 33.68±1.43 33.33±0.67

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠右后足趾腫脹度的影響 由表1可見，從造模后第2天開始，其他各組小鼠后足趾腫脹度顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。與模型組比較，從給藥后第17天即造模后第18天開始，陽性對(duì)照組小鼠足趾腫脹明顯降低（P＜0.05）；從造模后第26天開始，蛇肽低劑量組小鼠足趾腫脹度顯著降低（P＜0.01）；酒基組與蛇肽高劑量組均無顯著變化。

2.2 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠右后踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響 由表2可見，從造模后第2天開始，其他各組小鼠右后踝關(guān)節(jié)腫脹度顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。在造模后第18天，陽性對(duì)照組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低（P＜0.05）；造模后第26天，蛇肽低劑量組、蛇肽高劑量組、酒基組和陽性對(duì)照組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著降低（P＜0.05）；造模后第34天，陽性對(duì)照組、蛇肽高劑量組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著降低（P＜0.05），蛇肽低劑量組和酒基組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠體質(zhì)量的影響 由表3可見，從造模第18天開始，與對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組體質(zhì)量增加緩慢，但未呈現(xiàn)顯著性差異；但蛇肽低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第26天和第34天時(shí)，陽性對(duì)照組與蛇肽低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠脾臟指數(shù)的影響 造模后第34天，測定各組小鼠脾臟指數(shù)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組（2.90±0.22）比較，模型組小鼠的脾臟指數(shù)（4.49±0.08）升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組（4.49±0.08）小鼠相比，陽性對(duì)照組（3.10±0.76）的脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；酒基組（2.35±0.10）、蛇肽低劑量組（2.60±0.19）和蛇肽高劑量組（3.03±0.35）的脾臟指數(shù)均降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠血清CIC水平的影響 造模后第34天，測定各組小鼠血清CIC指數(shù)，結(jié)果顯示模型組（2.38±1.22）小鼠血清CIC指數(shù)顯著高于對(duì)照組（0.52±0.10）（P＜0.05）；與模型組相比，蛇肽低劑量組（0.65±0.14）和陽性對(duì)照組（0.37±0.09）的小鼠血清CIC指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠踝關(guān)節(jié)和右后足趾腫脹度的影響 有研究發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒素低、中、高劑量（2、10、50μg／kg）對(duì)大鼠右足踝關(guān)節(jié)腫脹均無顯著的抑制作用［8］。然而本研究發(fā)現(xiàn)：在足趾腫脹方面，陽性對(duì)照組效果顯著，蛇肽低劑量組效果極顯著。在踝關(guān)節(jié)腫脹方面，陽性對(duì)照組有顯著抑制效果，但蛇肽低劑量組效果極顯著，效果強(qiáng)于陽性對(duì)照組。從而說明蛇肽保健酒可明顯減輕關(guān)節(jié)炎外在癥狀，可出現(xiàn)受累關(guān)節(jié)腫脹減輕，防止組織局部組織損傷，對(duì)關(guān)節(jié)損傷有修復(fù)效應(yīng)［9］。但同時(shí)，酒基組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度也有顯著性降低。分析其原因：乙醇可以通過增強(qiáng)先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞的功能來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，無論是人或是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，低濃度乙醇均可能提高其免疫功能［10－13］，從而進(jìn)一步減輕踝關(guān)節(jié)腫脹。研究結(jié)果提示：地塞米松起效快，但蛇肽保健酒效果更為明顯，且蛇肽含量對(duì)抑制腫脹影響較大。

3.2 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠體質(zhì)量的影響 與對(duì)照組相比較，模型組與陽性對(duì)照組小鼠體質(zhì)量均有下降趨勢，且實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照組小鼠不活躍，毛色暗淡，可見地塞米松在治療關(guān)節(jié)炎的同時(shí)對(duì)機(jī)體也造成了一定的損傷，不良反應(yīng)較大。

3.3 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠脾臟指數(shù)的影響 脾臟作為體內(nèi)最大的淋巴器官，具有儲(chǔ)血、調(diào)節(jié)血量和參與免疫等重要功能。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病例的一個(gè)特征就是脾臟腫大［14］。蛇肽高、低劑量組小鼠脾臟腫大均顯著減輕，效果與地塞米松組相當(dāng)。同時(shí)酒基對(duì)降低脾臟腫脹也有效果，且與蛇肽低、高劑量組結(jié)果相似。

3.4 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠CIC的影響 CIC是RA的一個(gè)重要檢測指標(biāo)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)：僅蛇肽低劑量組與陽性對(duì)照組小鼠CIC顯著降低，并恢復(fù)為正常水平。提示蛇肽酒與地塞米松均對(duì)調(diào)節(jié)AA小鼠體液免疫發(fā)揮作用。

綜合以上5個(gè)測量指標(biāo)，低劑量蛇肽酒與地塞米松均對(duì)AA小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有顯著的治療效果，但低劑量蛇肽酒治療效果更好，且未見不良反應(yīng)。蛇肽酒對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的最佳治療劑量及其他功效有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］余克強(qiáng)，羅仁.青藤堿對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核源性樹突狀細(xì)胞趨化因子分泌和受體表達(dá)的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（4）：635－637，641.

［2］劉彥虹，盧秀敏.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身抗體類風(fēng)濕因子與抗瓜氨酸化蛋白抗體關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（9）：973－975.

［3］王勇，方勇飛，周新，等.青藤堿對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2003，7（7）：415－419.

［4］陳駿，李文勝，羅興菊，等.復(fù)方螞蟻酒對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的防治作用及其機(jī)制［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10（10）：12－13，16.

［5］劉岱岳，劉鵲華.蛇與蛇毒［N］.中國中醫(yī)藥報(bào)，2004－03－03.

［6］張春榮，余曉東，和七一，等.“蛇毒活性酒”功效的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7（14）：1416－1418.

［7］孫曉迪，李銀清，趙雨，等.鹿筋膠原對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用［J］.中國中藥雜志，2009，34（23）：3135－3138.

［8］張黎明，陳志龍，趙杰，等.眼鏡蛇毒素抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)研究［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2000，18（4）：209－211.

［9］楊曉軍.苗文麗.裴林.等.天星健骨方對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)的影響［J］.中醫(yī)臨床研究，2012，4（2）：5－6.

［10］Goral J，Karavitis J，Kovacs EJ.Exposure－dependent effects of ethanol on the innate immune system［J］.Alcohol，2008，42（4）：237－247.

［11］Mendenhall CL，Theus SA，Roselle GA，et al.Biphasic in vivo immune function after low－versus high－dose alcohol consumption［J］.Alcohol，1997，14（3）：255－260.

［12］Romeo J，Warnberg J，Nova E，et al.Changes in the immune system after moderate beer consumption ［J］.Ann Nutr Metab，2007，51（4）：359－366.

［13］Romeo J，Warnberg J，Diaz LE，et al.Effects of moderate beer consumption on first－line immunity of healthy adults［J］.J Physiol Biochem，2007，63（2）：153－159.

［14］文浩平，和七一，鄧疆渝，等.五步蛇毒素對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響［J］.毒理學(xué)雜志，2010，24（4）：306－308.