徐艷麗，李青菊

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 450014）

近年來(lái)他汀類藥物對(duì)糖尿病腎病非依賴降脂的腎臟保護(hù)作用越來(lái)越受到人們的重視。糖尿病腎病早期病理特征為腎小球系膜細(xì)胞的增殖與肥大［1］。p27是一種重要的細(xì)胞周期激酶抑制劑，其在腎小球系膜細(xì)胞增殖與肥大過(guò)程中起到重要作用［2］。他汀類藥物是否通過(guò)影響p27蛋白的表達(dá)來(lái)發(fā)揮非依賴降脂的腎臟保護(hù)作用目前還不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，觀察辛伐他汀及阿托伐他汀對(duì)高糖刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27蛋白表達(dá)的影響，以探討他汀類藥物的非依賴降脂腎臟保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎小球系膜細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)，細(xì)胞數(shù)量5×107），葡萄糖濃度為5.6mmol／L的低糖DMEM（細(xì)胞培養(yǎng)基）培養(yǎng)液（Thermo公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司），辛伐他?。∕erck公司），阿托伐他?。ㄝx瑞制藥有限公司），兔抗p27單克隆抗體（CST公司），鼠抗β－actin單克隆抗體（武漢博士德公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將大鼠腎小球系膜細(xì)胞置于含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每2天換液1次，待細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底的80%時(shí)可行傳代培養(yǎng)。傳至第5～6代可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前24h用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞分為4組（各組細(xì)胞數(shù)量106）：正常對(duì)照組：培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為5.6mmol／L；高糖組：葡萄糖濃度為30mmol／L；高糖辛伐他汀組：葡萄糖濃度為30mmol／L，辛伐他汀濃度為10μmol／L；高糖阿托伐他汀組：葡萄糖濃度為30mmol／L，阿托伐他汀濃度為10μmol／L。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于24、48、72、120h收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白及mRNA的測(cè)定。

1.2.2 觀察細(xì)胞形態(tài) 4組細(xì)胞分別在24、48、72、120h在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）測(cè)定細(xì)胞p27mRNA的表達(dá)采用Trizol試劑提取細(xì)胞總mRNA，RT－PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT－PCR法測(cè)定大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27mRNA的表達(dá)，RT－PCR引物詳細(xì)序列如下：p27引物序列：正鏈為5′－GGA CTT GGA GAA GCA CTG C－3′，反鏈為5′－CGA GTC AGG CAT TTG GTC C－3′，擴(kuò)增片段大小為282bp。GAPDH引物序列：正鏈為5′－GAC AAG ATG GTG AAG GTC GG－3′，反鏈為5′－CAT GGA CTG TGG TCA TGA GC－3′，擴(kuò)增片段大小為538bp。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸30s，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min，循環(huán)38次。PCR產(chǎn)物加于2%的瓊脂糖凝膠（0.5μg／mL EB），120V電泳20min。通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，測(cè)定電泳條帶的灰度，灰度值是將目的基因與內(nèi)參基因的電泳條帶灰度值相比作為數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 Western blotting測(cè)定細(xì)胞p27蛋白的表達(dá) 裂解液裂解細(xì)胞收集細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，取總蛋白75μg，經(jīng)12%的SDS－PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，并用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果。然后用含有封閉液的TBST室溫封閉1h，棄去原有封閉液，加入用5%脫脂奶粉稀釋的p27兔單克隆抗體（1∶1000稀釋）及β－actin單克隆抗體（1∶500稀釋），4℃過(guò)夜。洗膜后加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG（1∶4000稀釋），置于脫色搖床上，使之充分反應(yīng)2h。再次用TBST洗膜3次，每次15min，再次洗膜后加入ECL顯色劑，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)及Genetool軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，用測(cè)量得到的p27／β－actin光密度比值作為p27蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用表示，組間比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)學(xué) 正常對(duì)照組腎小球系膜細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，核呈圓形，居中間。高糖組細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，成旋渦狀排列。高糖辛伐他汀組和高糖阿托伐他汀組細(xì)胞數(shù)量減少。見圖1。

2.2 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27mRNA轉(zhuǎn)錄水平 表1結(jié)果顯示，在不同時(shí)間段，高糖組、高糖辛伐他汀、高糖阿托伐他汀組p27mRNA轉(zhuǎn)錄量均較正常對(duì)照組升高（P＜0.05）；在不同時(shí)間段，高糖辛伐他汀組、高糖阿托伐他汀組大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27mRNA表達(dá)較高糖組降低（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27蛋白表達(dá)水平 表2結(jié)果顯示，在不同時(shí)間段，高糖組、高糖辛伐他汀組、高糖阿托伐他汀組p27蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組升高（P＜0.05）；在48、72及120h，高糖辛伐他汀組p27蛋白表達(dá)均較高糖組降低（P＜0.05）；在24、48、72及120h，高糖阿托伐他汀組p27蛋白表達(dá)均較高糖組降低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)

表1 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27mRNA轉(zhuǎn)錄水平（，n＝6）

表1 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27mRNA轉(zhuǎn)錄水平（，n＝6）

a：P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與高糖組比較。

組別24h 48h 72h 120h正常對(duì)照組 0.384±0.175 0.386±0.210 0.392±0.172 0.395±0.182高糖組 1.006±0.182a 1.010±0.210a 1.384±0.175a 1.639±0.279a高糖辛伐他汀組 0.887±0.172a 0.697±0.249ab 0.656±0.096ab 0.560±0.144ab高糖阿托伐他汀組 0.866±0.085ab 0.688±0.256ab 0.630±0.166ab 0.537±0.141ab

表2 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27蛋白相對(duì)表達(dá)量（，n＝6）

表2 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27蛋白相對(duì)表達(dá)量（，n＝6）

a：P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與高糖組比較。

組別24h 48h 72h 120h正常對(duì)照組0.72±0.11 0.78±0.13 0.98±0.21 1.30±0.27高糖組 1.21±0.10a 1.45±0.18a 1.79±0.20a 2.09±0.13a高糖辛伐他汀組 1.08±0.05a 1.25±0.14ab 1.45±0.15ab 1.49±0.21b高糖阿托伐他汀組 0.86±0.14ab 1.27±0.11ab 1.31±0.16ab 1.52±0.20b

3 討 論

有文獻(xiàn)報(bào)道，高糖培養(yǎng)下腎小球系膜細(xì)胞前期以增殖為主，進(jìn)一步的高糖刺激，細(xì)胞復(fù)制停滯于G1期，引起細(xì)胞的肥大［3－6］。在高糖狀態(tài)下，p27蛋白的過(guò)度表達(dá)，抑制了細(xì)胞周期素激酶的活性，激酶活性的降低導(dǎo)致了腎小球系膜細(xì)胞停滯于G1期，不能正常進(jìn)入S期，出現(xiàn)肥大。國(guó)外研究報(bào)道，體外培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞在高糖刺激下也停頓于細(xì)胞周期的G1期，且發(fā)生了細(xì)胞的肥大［7］，并且p27蛋白水平也呈增高趨勢(shì)。與本研究結(jié)果較為一致。

近年來(lái)他汀類藥物的非依賴降脂的腎臟保護(hù)作用越來(lái)越受到人們的重視。糖尿病腎病的重要病理特征之一便是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF－β1）的過(guò)度表達(dá)，辛伐他汀可明顯降低高糖培養(yǎng)下腎小球系膜細(xì)胞上清液中TGF－β1的濃度的，并抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖及減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［8］。也有研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可通過(guò)降低糖尿病腎病患者血清相關(guān)炎癥因子如CRP、IL－6及TNF－α的水平進(jìn)而減少尿蛋白，保護(hù)腎臟功能［3，9］。阿托伐他汀可通過(guò)降低糖尿病腎病患者超敏C反應(yīng)蛋白、蛋白尿延緩腎功能的惡化［4，10］。阿托伐他汀也可抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖、抑制血管緊張素Ⅱ、TGF－β1的表達(dá)及分泌，進(jìn)而降低基質(zhì)蛋白的生成與沉積發(fā)揮保護(hù)腎臟的功能［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀與阿托伐他汀可明顯降低高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞p27蛋白表達(dá)水平及mRNA轉(zhuǎn)錄水平，據(jù)此可以認(rèn)為，辛伐他汀與阿托伐他汀可通過(guò)抑制p27蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期能夠順利地進(jìn)入S期，降低腎小球系膜細(xì)胞的肥大，減輕糖尿病腎病患者的腎臟肥大，對(duì)腎臟發(fā)揮保護(hù)作用。因此本研究建議，無(wú)論糖尿病患者有無(wú)脂質(zhì)代謝異常，均可以使用他汀類藥物治療早期糖尿病腎?。?2］。

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