曾 源，楊 威，張小強，李 斌，董 嘯

（南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心胸外科，江西南昌 330006）

前B細(xì)胞克隆增強因子（PBEF）是一種具有調(diào)控炎癥、糖脂代謝、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等多種作用的分子，并參與內(nèi)皮血管形成、心臟保護效應(yīng)、炎癥和免疫應(yīng)答等［1－2］。PBEF通過抑制中性粒細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生、調(diào)控肺血管上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的通透性等途徑在急性肺損傷中起到非常重要的作用［3－4］。本研究建立大鼠模型以分析PBEF在體外循環(huán)（CPB）術(shù)后肺血管內(nèi)皮通透性增加中的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型和分組 動物模型由南昌大學(xué)心血管病研究所提供，成熟雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量250～300g。進行動物分組，每組10組，對照組：大鼠只進行麻醉、CPB插管，不行CPB轉(zhuǎn)流；A組：大鼠行慢病毒AD－PBEFshRNA轉(zhuǎn)染；B組：大鼠進行30min深低溫停循環(huán)；C組：大鼠行慢病毒AD－PBEF－shRNA轉(zhuǎn)染后，再進行30min深低溫停循環(huán)。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本采集 大鼠處死后取右肺前葉用于肺組織濕干重比的測定，右肺中后葉固定于4%甲醛溶液中，乙醇脫水，石蠟包埋，切片成4μm厚。組織脫蠟后，用蘇木精和伊紅染色供病理觀察。取左肺等分置于兩個凍存管中，放入－80℃液氮中急凍保存，留待 Western blotting和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測。

1.2.2 Western blotting和ELISA檢測 Western blotting檢測：取出－80℃保存左肺組織，提取細(xì)胞總蛋白，電泳轉(zhuǎn)膜，進行一抗和二抗結(jié)合反應(yīng)，避光室溫振搖孵育1h，洗膜，熒光系統(tǒng)掃描，以β－actin作為內(nèi)參照，計算機記錄每個條帶的灰度積分值，以樣品積分值／內(nèi)參照積分值比值進行統(tǒng)計學(xué)分析。檢測包括PBEF表達(dá)，磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達(dá)。ELISA檢測：取大鼠外周血標(biāo)本5mL，3000r／min離心10min，取上清液儲于－80℃冰箱保存。取出血清并稀釋，再用濃縮洗滌液稀釋，加入底物顯示液，在酶標(biāo)板上與單抗結(jié)合，在相應(yīng)的波長處測各孔吸光度（A）值，求平均值。檢測包括MMP2／9和VEGF表達(dá)水平。

表1 PBEF、P38MAPK、ERK、MLC、VE－cadherin和FAK表達(dá)結(jié)果（，n＝10）

表1 PBEF、P38MAPK、ERK、MLC、VE－cadherin和FAK表達(dá)結(jié)果（，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與C組比較。

組別9±0.03 1.12±0.05 A組 2.32±0.68ab 2.83±0.72ab 3.05±0.66ab 2.61±0.63ab 2.32±0.71ab 2.91±0.69ab B組 2.13±0.83ab 2.51±0.81ab 2.86±0.73ab 2.33±0.91ab 2.11±0.69ab 2.65±0.75ab C組 4.15±0.92a 4.35±0.95a 4.51±0.88a 3.92±0.83a 4.03±0.86a 4.62±0.84 PBEF P38MAPK ERK MLC VE－cadherin FAK對照組 1.11±0.08 1.13±0.05 1.08±0.03 1.12±0.06 1.0 a

1.2.3 肺組織濕干重比（W／D） 右肺前葉肺組織稱濕重后，置入70℃烤箱內(nèi)，烘烤24h至恒重，稱干重，計算W／D比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PBEF、P38MAPK、ERK、MLC、VE－cadherin和FAK表達(dá)結(jié)果 A、B組的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達(dá)與對照組和C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化 MLC、磷酸化 VE－cadherin、磷酸化FAK表達(dá)與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 VEGF、MMP2、MMP9和 W／D表達(dá)結(jié)果 A、B組的MMP2、MMP9與對照組和C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組的VEGF、W／D與對照組和C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組的VEGF、W／D與C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 VEGF、MMP2、MMP9和 W／D表達(dá)結(jié)果（，n＝10）

表2 VEGF、MMP2、MMP9和 W／D表達(dá)結(jié)果（，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與C組比較。

組別 VEGF（pg／mL）MMP2（ng／mL）MMP9（ng／mL） W／D 71.03±3.515.12±0.132.88±0.083.21±0.42 A組 92.51±5.83ab 6.49±0.11ab 3.87±0.11ab 4.62±0.41ab B組 88.79±5.61b 6.28±0.23ab 4.01±0.09ab 4.13±0.36b C組 110.37±10.52a7.36±0.28a4.96±0.16a5.95±0.52對照組a

2.3 病理結(jié)構(gòu)改變 病理結(jié)果顯示，光鏡下對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡壁薄。C組可見嚴(yán)重肺組織病理損害，肺損傷程度重，肺間質(zhì)高度充血，大量中性粒細(xì)胞浸潤，小支氣管和小靜脈上皮細(xì)胞脫落，大部分肺泡間顯著增寬，肺泡腔部分萎縮，部分融合成肺大泡，腔內(nèi)有紅細(xì)胞，形成微血栓，而且會隨著時間的延長逐漸加重。A、B組較C組有不同程度的減輕，A組的程度是最低的。

3 討 論

CPB技術(shù)是開展心臟外科心內(nèi)直視手術(shù)的必備條件，但是CPB帶來的CPB術(shù)后肺功能障礙是人們不得不面對的一個難題［5－7］。肺缺血再灌注損傷的發(fā)生以及全身炎癥反應(yīng)是目前公認(rèn)的主要的CPB術(shù)后肺損傷發(fā)生機制。研究CPB術(shù)后肺損傷的分子機制有利于開發(fā)新的治療策略和新的防治藥物，減少CPB術(shù)后肺功能障礙的發(fā)生。

PBEF是B細(xì)胞早期分化的一種生長因子，具有促進前B細(xì)胞向B細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。研究表明炎癥細(xì)胞因子會促進細(xì)胞內(nèi)PBEF的表達(dá)，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制PBEF表達(dá)能夠完全消除炎癥細(xì)胞因子對中性粒細(xì)胞的抗凋亡作用［8－9］。報道指出在急性肺損傷動物模型的血清、肺組織及支氣管肺泡灌洗液中PBEF的基因表達(dá)明顯增加［10］。通過降低PBEF蛋白表達(dá)可以減少內(nèi)皮細(xì)胞的跨膜電阻，減少肌球蛋白輕鏈磷酸化和形成肌動蛋白，減少鈣離子的流動，從而改善凝血酶刺激造成的內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能障礙，減少急性肺功能損傷的發(fā)病率。PBEF過表達(dá)會延長炎癥反應(yīng)時間，增加肺泡上皮細(xì)胞核肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，釋放炎癥因子引發(fā)肺損傷。李潔［11］研究發(fā)現(xiàn)重癥急性胰腺炎發(fā)生相關(guān)肺損傷時，PBEF過表達(dá)而啟動白細(xì)胞介素（IL）－8、IL－1β和腫瘤壞死因子－α（TNF－α）等炎性細(xì)胞因子大量表達(dá)，在急性肺損傷中發(fā)揮重要作用。本研究制備模型大鼠并分組檢測，發(fā)現(xiàn)C組的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達(dá)與A、B組和對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可見PBEF高表達(dá)影響了磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達(dá)。P38MAPK、ERK是增殖信號通路中的關(guān)鍵分子，PBEF可能通過這些分子誘導(dǎo)VEGF和MMP2／9的表達(dá)。本研究中C組VEGF、MMP2、MMP9與A、B組和對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。有研究［12－15］報道VEGF在腎綜合征出血熱發(fā)病中的作用發(fā)現(xiàn)患者血管通透性增高可能與休克期VEGF高表達(dá)有關(guān)。本研究病理結(jié)果顯示，C組肺組織病理損害嚴(yán)重，A、B組較C組有不同程度的減輕。

綜上所述，PBEF通過P38MAPK、ERK等途徑調(diào)控磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達(dá)，而且依賴MAPK／PI3K－Akt／VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來誘導(dǎo)VEGF 和MMP2／9的表達(dá)，增加CPB術(shù)后肺血管內(nèi)皮通透性。

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