王 妍，徐酉華，胡艷妮，孫艷輝，金 鑫，楊桂存

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院／兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室／兒科學(xué)重慶市重點實驗室／重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地 400014）

急性白血病是兒童最常見的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的化療和干細(xì)胞移植使兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的5年生存率達(dá)到80%，而急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患兒的5年生存率只接近60%［1］。新型分子靶向化療藥物具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性，且對正常細(xì)胞不良反應(yīng)小。因此，尋找兒童AML的有效分子作用靶點至關(guān)重要。

糖原合酶激酶－3β（GSK－3β）是一種多功能的胞漿絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，研究證實它是治療2型糖尿?。?］、阿爾茨海默?。?］的有效藥物靶點，并且與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4］，但其在白血病中起激活作用還是抑制作用尚不明確。PTEN是第1個呈雙專一性磷酸酶活性的抑癌基因，它作為GSK3β的上游基因，可調(diào)控GSK3β的表達(dá)［5］。在成人急性白血病中存在與張力蛋白同源的位于第10號染色體磷酸酶基因（PTEN）基因的表達(dá)缺失［6］，但兒童 ALL患者骨髓標(biāo)本中PTEN蛋白的表達(dá)高于非惡性疾病兒童［7］。Polo樣激酶1（PLK1）是一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸激酶，可促進(jìn)有絲分裂的進(jìn)程，其抑制劑BI2536已經(jīng)進(jìn)入AML的Ⅰ期臨床實驗階段［8］。有研究認(rèn)為GSK－3β可能是PLK1的負(fù)調(diào)控因子，在維系PLK1的功能方面發(fā)揮作用［9］。本課題組研究GSK－3β、PTEN、PLK1在兒童AML的表達(dá)和臨床的關(guān)系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗組為2012年3～9月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科收治的33例初診AML患兒骨髓（M12例，M215例，M36例，M41例，M56例，M62例，M71例 ；中位年齡6歲2個月）。按形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、染色體、基因（MICM）分型標(biāo)準(zhǔn)診斷。根據(jù)患兒的臨床以及實驗室指標(biāo)按危險度分型將實驗組分為高危組、中危組、低危組，每組11例。對照組為10例骨科手術(shù)切除骨中抽吸的正常骨髓。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 無菌操作取骨髓液2～3mL，肝素抗凝，聚蔗糖（FicoLL）液（相對密度1.077g／mL）分離骨髓單個核細(xì)胞（BMMNC），取約5×106個細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，混勻后－80℃保存。

表1 GSK－3β、PTEN、PLK1、β－actin的引物及目的片段大小

1.2.2 裂解骨髓單個核細(xì)胞 離心沉淀細(xì)胞，加1mL裂解液RL充分裂解細(xì)胞。分別收集水相中的總RNA及有機(jī)相中的總蛋白。

1.2.3 RT－PCR檢驗 按北京百泰克生物技術(shù)有限公司高純總RNA快速提取試劑盒說明書提取RNA。按大連寶生物技術(shù)有限公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit Perfect Real Time說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。GSK－3β、PTEN、PLK1、βactin的引物及目的片段大小見表1，PCR條件：95℃預(yù)變性5 min；然后95℃變性30s；GSK－3β、PLK1、β－actin均為55℃退火30s，PTEN 60℃ 退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物分析 取PCR產(chǎn)物8μL在25～30g／L瓊脂糖凝膠中電泳，100V電泳45min。用紫外投射儀觀察并用粘膠成像儀照相，照片經(jīng)Metamorphose Imaging Sight軟件進(jìn)行分析并讀取吸光度值，分別取GSK－3β、PTEN、PLK1與actin吸光度比值（GSK－3β／actin、PTEN／actin、PLK1／actin）進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA） 采用ELISA雙抗體夾心法對有機(jī)相中的 GSK－3β、P－GSK－3β水平進(jìn)行定量分析。操作步驟嚴(yán)格按上海滬尚生物有限公司 GSK－3β及P－GSK－3β ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行。選擇450nm波長，在酶標(biāo)儀上測定A值，以標(biāo)準(zhǔn)品A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用表示，兩組間的比較采用t檢驗；組間兩兩比較采用F檢驗；兩組間的相關(guān)性研究采用Pearson相關(guān)檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA 在兩組BMMNC的表達(dá) 實驗組GSK－3βmRNA和PLK1mRNA的平均表達(dá)量較對照組的平均表達(dá)量高（P＜0.05）；實驗組PTEN mRNA的平均表達(dá)量較對照組的平均表達(dá)量低（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 兩組GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR檢測結(jié)果（）

表2 兩組GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR檢測結(jié)果（）

組別 n GSK－3β 330.55±0.16 0.50±0.16 0.71±0.18對照組 100.41±0.09 0.63±0.25 0.57±0.18 P mRNA PTEN mRNA PLK1mRNA實驗組0.012 0.012 0.040

2.2 GSK－3β蛋白及P－GSK－3β蛋白在兩組BMMNC的表達(dá)情況 實驗組GSK－3β蛋白的平均濃度較對照組的平均濃度高（P＜0.05）；實驗組P－GSK－3β蛋白的平均濃度較對照組的平均濃度低（P＜0.01）。見表3。

圖1 兩組 GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR檢測結(jié)果

表3 兩組 GSK－3β、P－GSK－3β的ELISA檢測結(jié)果（pg／mL，）

表3 兩組 GSK－3β、P－GSK－3β的ELISA檢測結(jié)果（pg／mL，）

組別 n GSK－3β P－GSK－3β 33 2553.40±358.59 294.17±40.53對照組 10 2204.02±283.52 350.53±53.32 P實驗組0.014 0.002

2.3 GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA、GSK－3β蛋白及P－GSK－3β與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 實驗組GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA、GSK－3β蛋白 及 P－GSK－3β的表達(dá)與性別、肝脾是否腫大均無明顯相關(guān)性，僅GSK－3β蛋白的表達(dá)與外周血白細(xì)胞計數(shù)增高呈正相關(guān)（P＝0.011）。臨床危險度高則 GSK－3βmRNA［高危組高于中危組（P＝0.012），高危組高于低危組（P＝0.000）］、GSK－3β蛋白［高危組高于中危組（P＝0.012），高危組高于低危組（P＝0.003）］、PLK1mRNA［高危組高于低危組（P＝0.009）］表達(dá)相應(yīng)增高。臨床危險度高則P－GSK－3β表達(dá)減低［高危組低于中危組（P＝0.047），高危組低于中危組（P＝0.036）］。PTEN mRNA的表達(dá)與臨床危險度分型無明顯相關(guān)性。

2.4 GSK－3β與PTEN mRNA、PLK1mRNA表達(dá)的相關(guān)性本研究中 GSK－3βmRNA、P－GSK3β與 PTEN mRNA 的表達(dá)無明顯相關(guān)性（r＝－0.265，P＝0.136；r＝0.023，P＝0.899），GSK－3β蛋白與PTEN mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.415，P＝0.016）。GSK－3βmRNA、GSK－3β蛋白與PLK1mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.388，P＝0.026；r＝0.427，P＝0.013），P－GSK3β與PLK1mRNA的表達(dá)無明顯相關(guān)性（r＝－0.319，P＝0.070）。

3 討 論

分子靶向藥物在白血病治療中發(fā)揮越來越重要的作用。近來研究表明GSK－3β為癌基因，使用GSK－3β的抑制劑BIO后TF－1、U937、K562和HL60細(xì)胞大量凋亡，但不影響正常造血干細(xì)胞的活性［10］。另有研究表明GSK－3β為抑癌基因，在APL中，ATO激活GSK－3β誘導(dǎo) Mcl－1降解進(jìn)而誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化［11］。本課題組前期研究表明兒童ALL中GSK－3β起癌基因的作用［12］。本實驗結(jié)果顯示兒童AML中GSK－3β在基因及蛋白水平均高表達(dá)，且表達(dá)水平與臨床分型呈正相關(guān)，GSK－3β蛋白與外周血白細(xì)胞計數(shù)呈正相關(guān)；P－GSK－3β低表達(dá)，與臨床分型呈負(fù)相關(guān)。因此，GSK－3β在兒童AML中可能同樣起癌基因的作用。

本研究中兒童AML骨髓標(biāo)本中PTEN mRNA的表達(dá)量明顯低于對照組，其在兒童AML中可能起抑癌作用，但其表達(dá)量與臨床指標(biāo)無相關(guān)性。

PLK1目前被認(rèn)為是腫瘤治療過程中有價值的作用靶點，在AML動物模型中，PLK1的特異性的抑制劑NMS－P937聯(lián)合阿糖胞苷口服后，可使其較好地長期存活［13］；在成人AML中PLK1高表達(dá)，與不良預(yù)后呈明顯正相關(guān)［14］。本研究中兒童AML骨髓標(biāo)本中PLK1mRNA的表達(dá)量同樣明顯高于對照組，且其表達(dá)量與臨床分型呈一定正相關(guān)，表明PLK1在兒童AML中可能同樣起癌基因的作用。

腫瘤中抑癌基因PTEN主要通過兩種作用途徑調(diào)控GSK－3β的表達(dá)：一種為通過降低對PI3K／AKT信號通路的抑制，增強(qiáng)AKT對GSK－3β的抑制性磷酸化，GSK－3β的表達(dá)減少［5］；一種為通過增強(qiáng)對cdc42活性的抑制，降低cdc42信號通過對GSK－3β的抑制作用，GSK－3β的表達(dá)增加［15］。本研究初步顯示兒童AML中，GSK－3β蛋白與PTEN mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)。因此，兒童AML中，PTEN可能主要通過cdc42信號通路調(diào)控GSK－3β的轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)。

在肺癌中，GSK－3β的抑制劑LiCl能增強(qiáng)PLK1的啟動子活性，促進(jìn)PLK1的表達(dá)，提示GSK－3β可能是PLK1的負(fù)調(diào)控因子［9］。而本研究結(jié)果顯示 GSK－3βmRNA、GSK－3β蛋白與PLK1mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)。本課題組前期研究表明兒童ALL中 GSK－3β高表達(dá)，且其正向調(diào)控 NF－κB信號通路［12］。Lin等［16］研究表明 NF－κB的亞基 RelA 通過直接與PLK1的啟動子結(jié)合，增強(qiáng)PLK1的轉(zhuǎn)錄。因此，在兒童AML中，GSK－3β可能通過正向調(diào)控 NF－κB信號通路從而增強(qiáng)PLK1的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，兒童AML中，GSK－3β和PLK1可能起癌基因的作用，而PTEN起抑癌基因的作用，三者在白血病中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討，可能成為兒童AML危險度分型的指標(biāo)及靶向治療的有效作用靶點。

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