殷 瓅， 陸允敏， 金 湧， 陳維雄， 朱金水， 陳尼維

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院消化內科， 上海 200233)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(crohn disease，CD)。它在我國近年來發(fā)病率逐年增加，臨床傳統(tǒng)治療藥物仍以水楊酸類、糖皮質激素、免疫抑制劑三類為主。本實驗以噁唑酮誘導小鼠實驗性結腸炎模型，通過觀察HGF對模型小鼠的臨床和組織學表現(xiàn)以及P-選擇素表達量的影響，探討HGF用于IBD輔助治療的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物:健康昆明小鼠60只，7-8周齡，體重25-30g，由上海復旦大學實驗動物中心提供并按無特殊病原體(SPF)動物飼養(yǎng)要求飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和設備:噁唑酮試劑(美國Sigma公司);肝細胞生長因子;FQ-PCR試劑盒及耗材(中山醫(yī)科大學達安基因診斷中心);旋渦振蕩器(Vortex)(上海青浦瀘西儀器廠);干式恒溫器(杭州藍焰科技有限公司);冷藏冰箱(伊來克斯);低溫冷凍離心機(美國Sigma公司);生物安全柜(美國Sigma公司);紫外殺毒車(上海躍進醫(yī)用光學器械廠);Real-time檢測儀(7500Sequence Detection System)(美國 ABI公司)。

1.3 實驗分組與處理:將實驗動物昆明小鼠隨機分成六組:正常組、模型組、生理鹽水組、肝細胞生長因子(HGF)組、柳氮磺胺吡啶(SASP)組、聯(lián)合用藥組(SASP+HGF)，每組各10只。除正常組(10只)外，其余動物均按Heller等[1]描述的方法并加以改進，建立噁唑酮誘導的結腸炎模型。第1d，小鼠背部皮膚剃毛(2 cm×2 cm)，皮膚滴注3%噁唑酮(Sigma Chemical Co，Louis USA)(溶解于100%乙醇中)0.2mL，自然風干;第2d，重復滴注1次。第8d，將直徑2mm的硅膠管從肛門插入小鼠腸道深約4cm，注入1%噁唑酮(溶解于50%乙醇中)0.15mL，注入后將小鼠倒置30s，以防止回流。

正常組:常規(guī)飼養(yǎng)。

模型組:灌腸后，正常飼養(yǎng)。

生理鹽水組:第9d開始每天使用生理鹽水0.1mL腹腔注射一次，共4d。

HGF組:第9天開始每天一次使用HGF(100μg/只/d)溶解于生理鹽水中，腹腔注射，共4d。SASP組:第9天開始每天一次使用SASP(200mg·kg-1·d-1)溶解于蒸餾水中，灌胃，共4d聯(lián)合用藥組:第9天開始同時使用 HGF(100μg/只/d)灌腸及 SASP(200mg.kg-1.d-1)灌胃。給藥共4d，每天一次。

1.4 結腸炎癥程度評估:第8天灌腸后進行疾病活動指數(shù)(DAI)評分。DAI=(體質量下降分值+糞便性狀分值+便血分值)/3，分值范圍為0-4(見表1)。

表1 DAI評分標準

第12天，所有模型小鼠均禁食;第13天，頸椎脫臼法處死小鼠，即刻將大腸取出進行肉眼觀察:按Ekstrm[2]描述的標準行大體損傷評分:無損傷，0分;黏膜充血，1分;潰瘍面積≤受損面積的25%，2分;25%-50%，3分;≥50%，4分;分值范圍為0-4分。

取病變部位標本(2mm×10mm)，以中性福爾馬林液固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下行組織病理學檢查。參考Ekstrom[2]的評分標準進行細化后對病變結腸行組織學損傷評分，所有項目的分值相加即為總分(見表2)。

表2 結腸炎組織學損傷評分標準

1.5 熒光定量PCR檢測P-選擇素的表達量:根據GenBank數(shù)據庫發(fā)表的基因序列，設計合成P-選擇素的引物和探針:TaqMan探針5'-AGG CAC TTC ACA GAC TTA GTG GCC AT-3;正義引物 5'-GCA TAC TCA TGG AAT AAC TCA CG-3';反義引物5'-GAC GTC ATT GAG GTG AGC G–3'

取米粒大小的結腸組織，放入去核酶試管中，加入500μLTROZOL，勻漿機磨碎;轉入 EP 管中，加入200μL氯仿后混勻;放入4℃離心機中，12000rpm離心15min;取上清液，轉移入EP管中，再加入600μL異丙醇;-20℃冰箱靜置30min;取出放入4℃離心機中，12000rpm離心 15min，棄上清液后加入75%酒精650μL，洗滌沉淀;放入離心機中離心后，棄上清液，65℃烘干5min;用20μLDEPC處理水溶解沉淀物，將經過稀釋后的RNA樣本進行RT，反應體系如下(5×逆轉錄反應緩沖液 4μL，oligo(d T)0.5μL，dNTPs 0.5μL，逆轉錄酶 MmLV 1μL，DEPC 處理水 10μL，RNA模板4μL)總體積20μL。將制備好的cDNA進行PCR擴增，擴增體系如下:5×PCR反應緩沖液10μL、上游引物 F 0.5μL、下游引物 R 0.5μL、dNTPs 0.5μL、Taq-Man 熒光探針0.5ul、Taq 酶 1μL、ddH2O 水 32μL、cDNA模板5μL。擴增條件:①50℃2min;②95℃5min;③95℃15s，60℃45s 40個循環(huán)。數(shù)據采用儀器附帶軟件(ABI Prism 7000 SDS Software)分析，根據標準曲線計算每個基因的拷貝數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析:應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據以±s表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況和結腸炎癥程度評估:實驗過程中各組均無小鼠死亡。正常對照組小鼠活動、進食正常，無明顯體質量減輕和腹瀉;模型組小鼠在灌腸24h后即出現(xiàn)懶動、厭食、肉眼血便和體重減輕，第9-10 d時達高峰。NS組小鼠經NS腹腔注射，癥狀持續(xù)存在。但經HGF腹腔注射或SASP灌胃后的小鼠血便、腹瀉明顯減輕，體重未見明顯下降。

模型組和NS組的小鼠DAI評分明顯高于正常組(P＜0.01);模型組和NS組之間的DAI評分無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);HGF組、SASP組和聯(lián)合用藥組，用藥后的DAI評分明顯低于模型組(P＜0.01)，而與正常組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);聯(lián)合用藥組的DAI評分要低于HGF組和SASP組，但三組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(見表3)。

解剖小鼠發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠結腸黏膜無水腫、糜爛及潰瘍形成，鏡下無損傷表現(xiàn)。模型組和NS組病變主要累及遠端結腸。組織學檢查發(fā)現(xiàn)病變表淺，可見黏膜水腫、糜爛、出血、上皮細胞缺失和再生少許淺表小潰瘍、病變連續(xù)存在，黏膜和黏膜下層以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，杯狀細胞減少，偶見隱窩膿腫形成。HGF組、SASP組和聯(lián)合用藥組小鼠結腸黏膜未見明顯的炎性細胞浸潤及充血水腫與糜爛、潰瘍等。

模型組和NS組的小鼠大體形態(tài)學評分和組織學評分明顯高于正常組(P＜0.01);模型組和NS組之間的大體形態(tài)學評分和組織學評分無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);HGF組、SASP組和聯(lián)合用藥組用藥后的大體形態(tài)學評分和組織學評分明顯低于模型組(P＜0.01)，而與正常組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);聯(lián)合用藥組的大體形態(tài)評分和組織學評分要低于HGF組和SASP組，但三組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(見表3)。

2.2 P-選擇素的表達:在小鼠LPMC中，模型組及NS組的P-選擇素表達量明顯高于正常組(P＜0.01)。HGF組、SASP組和聯(lián)合用藥組P-選擇素表達量較模型組和NS組顯著降低(P＜0.01)。HGF組和聯(lián)合用藥組P-選擇素表達量與正常組相比，無統(tǒng)計學意義。SASP組P-選擇素表達量較正常略有下降(P＜0.05)(見表4)。

表3 各組DAI、大體形態(tài)和組織學評分(?±s)

表4 P－選擇素的表達(±s)(mRNA%)

表4 P－選擇素的表達(±s)(mRNA%)

Compared with normal group，*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;Compared with model group，#P＜0.05，##P＜0.01;Compared with NS group，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 P-選擇素表達量正常組 0.5369±0.0125##△△模型組 0.9695±0.0316 ＊＊NS組 0.9764±0.0146 ＊＊HGF 組 0.5449±0.0153##△△SASP 組 0.5578±0.01799*##△△HGF+SASP 組 0.5435±0.0168##△△

3 討論

噁唑酮誘導的小鼠實驗性腸病，其組織學特征和炎癥分布均類似人類潰瘍性結腸炎，是一種較為滿意的UC動物模型[3]。本實驗選用噁唑酮誘導的小鼠實驗性腸病模型進行肝細胞生長因子的療效及作用機制的研究。

肝細胞生長因子(HGF)是一種多功能生長因子，可刺激上皮細胞運動、侵襲、增殖和形態(tài)形成，可能在胚胎發(fā)生、損傷修復、器官再生、炎癥反應、腫瘤侵襲等多種生理、病理過程中發(fā)揮生物學效應[5]。近年文獻報道HGF可調節(jié)腸上皮細胞的增殖和遷移，促進黏附損傷修復，因此有可能成為IBD的輔助治療藥物之一[6]。

HGF是一種由間質細胞(如成纖維細胞，血管平滑肌細胞，神經膠質細胞，巨噬細胞及活化的T淋巴細胞等)產生的多功能生長因子。HGF來源于單鏈的728個氨基酸殘基前體，被特異性絲氨酸蛋白酶水解為成熟的HGF。HGF是異二聚體雙鏈結構，含有一個分子量69 kd的α鏈和一個分子量34 kd的β鏈。不同種屬的HGF具有高度的同源性，不同來源、不同種屬的HGF結構基本相似;HGF最初被認為是一種能刺激肝細胞增生的分子，現(xiàn)在已被認為是一種具有多種功能的細胞因子。P-選擇素主要存在于活化的血小板和內皮細胞的表面，是介導白細胞游出血管的主要黏附分子之一，與多種炎性細胞的活化和浸潤密切相關，在炎癥反應中起重要作用，以往有研究發(fā)現(xiàn)UC患者周圍血中和患者腸黏膜經超聲破碎后上清液中P-選擇素的含量顯著增高[4]。P-選擇素在炎癥發(fā)生、發(fā)展和細胞的粘附轉移過程中起重要作用。

在本實驗中，正常組小鼠無體重減輕、腹瀉等癥狀，說明飼養(yǎng)環(huán)境較理想;而模型組小鼠在灌腸24h后即出現(xiàn)懶動、厭食、肉眼血便和體重減輕，提示造模成功。NS組使用生理鹽水腹腔注射，小鼠的臨床癥狀無改善，也無明顯惡化，提示腹腔注射對于小鼠創(chuàng)傷很小。HGF或(和)SASP用藥后，小鼠癥狀明顯改善，表明小鼠預后良好。且HGF組、SASP組和聯(lián)合用藥組之間無統(tǒng)計學差異。

在大體形態(tài)學及組織學方面，模型組和NS組也證實了小鼠腸道確實發(fā)生器質性損傷。進一步證實了造模的成功。另外，HGF組、SASP組和聯(lián)合用藥組雖較正常組略有水腫、充血，但與正常組相比統(tǒng)計學無明顯差異。尤其是聯(lián)合用藥組，腸道的大體及病理學檢查，都更接近正常組小鼠。

本實驗中，模型組和NS組的P-選擇素明顯高于正常組，而HGF組和聯(lián)合用藥組明顯低于模型組，SASP組雖低于模型組，但仍高于正常組。說明SASP聯(lián)合HGF后對于降低P-選擇素，抗炎癥效果較好。

[1]Heller F，F(xiàn)uss IJ，Nieuwenhuis EE，et al.Oxazolone colitis，a thcolitis model resembling ulcerative colitis，is mediated by IL-13-producing NK-T cells[J].Immunity，2002，17(5):629-638.

[2]Ekstrom GM.Oxazolone-induced colitis in rats:effects of budesonide，cyclosporin A，and 5-aminosalicylic acid[J].Scand Gastroenterol，1998，33(2):174-179.

[3]黃曉麗，易文全，尹靜，等.炎癥性腸病實驗研究的動物模型[J].臨床消化病雜志，2007，19(1):58-62.

[4]Fagerstam J P，Whiss PA ，Strom M et al.Expression of platelet P-selectin and detection of soluble P-selectin，N YP and RANTES in patient with inflammatory bowel disease[J].Inflamm Res，2000，49(9):466-472.