簡利茹，王海瑛，韓青梅

1(旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室(西北農林科技大學)，陜西 楊凌，712100)2(西北農林科技大學植保學院，陜西 楊凌，712100)

蘋果樹腐爛病是由蘋果黑腐皮殼菌(Valsa mali Mayabe et Yamada)引起的一種蘋果樹枝干病害［1-2］，在我國各蘋果產區(qū)普遍發(fā)生，可以使蘋果樹主枝、主干枯死，給蘋果產業(yè)造成嚴重的經濟損失［3-5］。王建華等［6］報道，蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液中有機酸對根皮苷的降解有很大影響，所以研究發(fā)酵過程中有機酸的生成量及葡萄糖的消耗速率，對于確定菌體內的代謝通量分布及發(fā)酵過程的優(yōu)化控制都具有重要意義。

近年來，有機酸和葡萄糖的檢測方法多用高效液相色譜法(HPLC)，如胡志群等［7］用高效液相色譜測定荔枝果肉的酸和糖是用不同的柱子分開檢測，此法分析時間長，流動相損耗大，易污染。姜岷等［8］利用Aminex HPX-87H 離子排斥色譜柱測定纖維素水解液厭氧發(fā)酵產丁二酸發(fā)酵液中有機酸和混合單糖，由于氫離子交換柱較貴，一般實驗室不具備此柱子。白冬梅等［9］利用Eclipse XDB-C8柱同時檢測琥珀酸發(fā)酵液中的有機酸和葡萄糖，圖譜分離效果不好，拖尾嚴重。因此，對蘋果樹腐爛病菌等微生物發(fā)酵液這種培養(yǎng)基組分復雜而待測物含量較低的樣品，一種高靈敏度快速測定的方法顯得尤為重要。本研究應用C18柱，采用HPLC 法串聯(lián)兩種檢測器進行檢測，建立了一種能夠快速準確測定蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液中有機酸和葡萄糖的方法。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

試劑:蘋果酸(色譜純)、乳酸(色譜純)、檸檬酸(色譜純)、富馬酸(色譜純)、琥珀酸(色譜純)及葡萄糖(色譜純)均購自SIGMA 公司。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，實驗用水為Milli-Q 二次超純水。蘋果樹腐爛病菌由西北農林科技大學植物病害綜合防治實驗室提供。

儀器:Waters 600 型高效液相色譜儀，美國Waters 公司;PB-10 型酸度計，德國Sartorius 公司;Mill-Q水處理系統(tǒng)，MILLPORE 美國公司。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)液成分(g/L):葡萄糖10，L-天門冬酰胺2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.88，F(xiàn)e(NO3)3·H2O 0.0015，MnSO4·5H2O 0.000 44，去離子水1L。

1.3 發(fā)酵液的制備

在200 mL 滅菌液體培養(yǎng)基中，加入7 塊直徑7 mm 的蘋果樹腐爛病菌菌餅，25℃下靜置培養(yǎng)，每天振搖2 次。定期取1 mL 發(fā)酵液于10 000 r/min 轉速下離心10 min，取上清液經0.22 μm 針式水膜過濾后進樣10 μL 進行高效液相檢測。

1.4 混合標準溶液的配制

精確稱取蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸各100 mg、富馬酸2 mg 和葡萄糖6 g，用二次水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配置成標準混合溶液，其中富馬酸0.02 mg/mL、葡萄糖60 mg/mL，其他組分1 mg/mL，再用二次水將標準溶液分別稀釋2 倍、10 倍、50倍、100 倍、200 倍及1 000 倍。

1.5 色譜條件

采用Waters600 型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，以5 g/L NH4H2PO4(用磷酸調pH=2.5)溶液為流動相;分析柱為Atlantis C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，3.5 μm);流速0.6 mL/min;柱溫30℃;Waters 2487 紫外檢測器，檢測波長210 nm;Waters 2414示差檢測器，檢測器溫度40℃;上樣量為10 μL。

2 結果與討論

2.1 HPLC 實驗方法的建立

2.1.1 色譜柱的選擇

有機酸常采用C18硅膠柱進行分離，因有機酸極性較大，使用的流動相中水的比例較高，一般色譜柱在高水相環(huán)境中容易疏水塌陷，因此實驗中選用了更耐水相的Waters 公司的Atlantis C18色譜柱。

2.1.2 柱溫的選擇

設定柱溫20℃、30℃、38℃對標準溶液中各組分進行分離。由于溫度升高時會增加有機酸的離解，各有機酸分離效果不好;但溫度降低組分的響應值減小，保留時間增加，分析時間延長。比較不同溫度下的分離曲線圖譜，選擇最佳分離溫度為30℃。

2.1.3 檢測器的選擇

利用有機酸及葡萄糖對紫外檢測器及示差檢測器響應信號強弱的差異，同時經過Atlantis C18色譜柱有效的分離，洗脫樣品先經紫外檢測器檢測其中的有機酸，再經示差檢測器檢測葡萄糖。示差檢測器溫度設定為恒定40℃。

2.1.4 流動相pH 值的選擇

有機酸為弱酸性，在流動相水的比例較大的環(huán)境中易被電離。流動相合適的pH 值會改善峰形對稱，減少峰拖尾。通過了解有機酸的解離常數(shù)［10］，本實驗考查了流動相的pH 值在2 ～3 對分離的影響，結果表明，pH 值越小峰型越好，考慮到C18柱對酸的耐受性，本實驗最終選用流動相的pH 為2.5。

2.1.5 流動相緩沖鹽濃度的選擇

分別配成濃度為2 g/L、5 g/L、8 g/L、10 g/L 的NH4H2PO4溶液(用磷酸調pH 為2.5)對標準溶液進行分析以考察緩沖鹽濃度對色譜分離的影響。結果表明:當緩沖鹽濃度大于5g/L 時，各組分都得到有效分離。由于緩沖鹽濃度越大對泵和色譜柱的壽命都會產生影響，所以最終選用5 g/L 的NH4H2PO4作為流動相。

2.2 標準曲線和線性范圍的測定

取各系列混合標準溶液10 μL，在最佳色譜條件下上機進行分析，混合標樣(富馬酸0.4 μg/mL，葡萄糖1.2 mg/mL，其他有機酸20 μg/mL)的紫外(UV)和示差(RI)色譜圖如圖1。從圖1 可以看出，在210 nm 下，除葡萄糖外，其他有機酸都能被很好地分離并被紫外檢測器檢測出;而示差檢測器對富馬酸沒有響應，雖其他有機酸能夠和葡萄糖很好的分離但響應較低。最終確定以紫外檢測器分析有機酸，以示差檢測器分析葡萄糖，各組份的峰面積y 對濃度x 進行線性回歸，得到各物質的線性回歸方程。線性范圍、相關系數(shù)和檢出限(信噪比為3)等定量參數(shù)見表1 。

圖1 混合標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standards mixtures

表1 標準曲線的線性參數(shù)Table1 The linear parameters of standard curves

2.3 發(fā)酵液樣品的測定

取蘋果樹腐爛病菌搖瓶發(fā)酵不同時間(0、1、2、4、6 d)的發(fā)酵液，在上述分離條件下進行色譜分析，測定其葡萄糖的消耗和產生的有機酸，結果見表2，圖2 為發(fā)酵2d 的色譜分離圖。

表2 不同發(fā)酵時間的測定結果Table 2 The determination results of different fermentation time

從圖2 可知，蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵產物比較復雜，除了產生一些有機酸外，還有其他一些未知物。從表2 可以看出隨著發(fā)酵時間的延長，有機酸的產量都呈上升趨勢，而葡萄糖經過6d 發(fā)酵后幾乎消耗殆盡。

2.4 方法的回收率和重復性試驗

取同一發(fā)酵液4 份，其中一份作本底，按上述實驗方法重復測定5 次，考察方法精密度;另3 份各添加一定量的標準物質，考察回收率，結果見表3。本方法的回收率為96.2% ～102.2%，精密度為0.26%～0.75%，且不受發(fā)酵液中大量雜質的干擾。

圖2 蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液色譜圖Fig.2 Chromatogram of Valsa mali Var. mali fermentation liquid

表3 回收率和精密度實驗結果(n=5)Table 3 Results of recovery and precision (n=5)

3 結論

蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液經過離心處理后，采用反相Atlantis C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，以5 g/L NH4H2PO4溶液(pH2.5)為流動相，流速0.6 mL/min，柱溫30℃，采用不同的檢測器，可同時分析待測樣中的有機酸及葡萄糖，每一樣品的分析過程不超過15min。此方法快速、高效、準確，可用于在線監(jiān)測發(fā)酵過程中底物的利用情況及產物生成情況，確定菌體內的代謝通量分布，從而對發(fā)酵過程的優(yōu)化控制具有重要的意義。

［1］ Wang X L，Wei J L，Huang L L，et al. Re-evaluation of pathogens causing Valsa canker on apple in China［J］.Mycologia，2011，103(2):317 -324.

［2］ 高克祥，劉曉光. 蘋果樹腐爛病研究概況［J］. 西北林學院學報，1995，10(1):87 -91.

［3］ 張滿良. 農業(yè)植物病理學［M］. 西安:世界圖書出版公司，1997.

［4］ 陳策. 蘋果樹腐爛病發(fā)生規(guī)律和防治研究［M］. 北京:中國農業(yè)科學技術出版社，2009:9 -17

［5］ 曹克強，國立耘，李保華，等. 中國蘋果樹腐爛病發(fā)生和防治情況調查［J］. 植物保護，2009，35(2):114 -117.

［6］ 王建華，柯希望，黃以超，等. 蘋果樹腐爛病菌發(fā)酵液中根皮苷主要降解成分的分析［J］. 西北農林科技大學學報(自然科學版)，2012，40(8):89 -95.

［7］ 胡志群，王慧聰，胡桂兵. 高效液相色譜測定荔枝果肉中的糖、酸和維生素C［J］. 果樹學報，2005，22(5):582 -585.

［8］ 姜岷，雷丹，陳可泉，等. 纖維素水解液厭氧發(fā)酵產丁二酸發(fā)酵液中有機酸和混合單糖的測定［J］. 分析化學，2009，37(4):605 -608.

［9］ 白冬梅，杜國民，沈菲，等. 反相HPLC 同時測定產琥珀酸放線桿菌發(fā)酵液中的有機酸與葡萄糖［J］. 分析試驗室，2004，23(3):15 -18 .

［10］ 趙景嬋，郭治安，常建華，等. 有機酸類化合物的反相高效液相色譜法的分離條件研究［J］. 色譜，2001，19(3):260 -263.